| 研究課題/領域番号 |
16H06290
|
|---|
| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
|---|
研究代表者 |
伊藤 幸成 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 主任研究員 (80168385)
|
|---|
| 研究分担者 |
武田 陽一 立命館大学, 生命科学部, 准教授 (20423973)
松尾 一郎 群馬大学, 大学院理工学府, 教授 (40342852)
梶原 康宏 大阪大学, 理学研究科, 教授 (50275020)
迫野 昌文 富山大学, 大学院理工学研究部(工学), 准教授 (50391959)
井原 義人 和歌山県立医科大学, 医学部, 教授 (70263241)
戸谷 希一郎 成蹊大学, 理工学部, 教授 (80360593)
平林 義雄 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 客員主管研究員 (90106435)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2016-04-26 – 2021-03-31
|
| キーワード | 小胞体 / 糖修飾 / 糖タンパク質 / 糖脂質 / 糖鎖 / 品質管理 |
|---|
| 研究実績の概要 |
・糖タンパク質の品質管理機構に関わる因子の機能解明に向け，糖タンパク質型酵素およびその糖鎖が除去された酵素を半合成により調製し解析した。その結果，上記の因子が秩序をもってフォールディングプロセスに寄与していることを明らかにした。加えて，軽微なミスフォールド体は速やかに天然型に戻されるが，凝集体はほとんどリフォールドしないことが確認できた。この過程に影響する小分子阻害剤を開発するとともに，疾患との連動に関する知見を得た。
・糖タンパク質フォールディングに関わる因子の複合化を検出するクロスリンカーを開発し，夾雑系でも機能することを明らかにした。小胞体内に複数存在するマンノシダーゼ類が，糖鎖分岐様式を見分けていることを証明するとともに，小胞体内エンドマンノシダーゼ様活性の発現に，カルボキシエステラーゼが関与していることを見出した。
・小胞体に存在するERp29がカルネキシンと複合化を行うことを見出し、化学架橋や固定化粒子を用いた実験から，複合体の構成に関する知見を得た。
・合成研究に関しては１）高マンノース型糖鎖構造の迅速合成，２）新たな概念による立体選択的グリコシル化，３）擬ラセミ体結晶化に向けた鏡像体型タンパク質の合成、４）エンドマンノシダーゼの活性を検出するプローブの開発、において成果を得た。
・ホスファチジルグルコシド(PtdGlc)の生合成に関して、ホスファチジン酸の飽和脂肪酸部分が厳密に認識されていることが示された。一方、リソPtdGlcのGPR55認識機構の解明と、より創薬に適したアナログの開発を行った。
・動物細胞レベルの解析から、C-マンノシル化糖修飾の小胞体フォールディング過程への関与が示唆された。また、Man転移反応には、ドリコール-リン酸-Manの合成経路が供給源として重要であることもわかった。またC-Man-Trpの生体サンプルでの定量分析系を確立した。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
糖タンパク質のプロセシングと品質管理機構の解明について、小胞体破砕液を用いた研究に取り組んで来た。今年度は糖タンパク質酵素の半合成に成功し、活性を指標にしたフォールディング評価が可能になった。また、糖鎖部分の合成についても、様々な形で最適化が進んでいる。一例として、単一の供与体から両方の異性体を作り分ける手法を開発し、本課題で主として取り扱う糖鎖の構成単位であるグルコースおよびマンノースのグリコシル化について汎用性を確かめた。
小胞体糖鎖トリミング経路に関しては、内側のグリコシド結合様式が識別されことや、不良糖タンパク質を分解経路に受け渡す新規酵素活性にカルボキシエステラーゼが関与することを見出したことなど、EDEM類やエンドマンノシダーゼの機能解明に向けて着実に進捗しているものと考えている。加えて、ERp29という新たな因子の関与が明らかになりつつある。
C-Man化される分泌タンパク質について，タンパク質品質管理との関連について解析を進めてきた。その結果、C-Man化がジスルフィド結合を介したタンパク質の酸化・還元フォールディングの制御に関与することがわかった。さらに、対するC-Man転移反応が、小胞体におけるドリコール-リン酸-マンノースの合成経路不全細胞株では著しく抑制されることから、本経路がマンノース基質の供給源として重要であることもわかった。一方、C-Man化修飾の最小単位であるC-Man-Trpの生体サンプルでの分析測定系を新たに確立し、マウス全身の組織分布の解析が可能になった。
また、LPGlc 類縁体の構造活性相関をもとに、新規アナログを開発した。GPR55アゴニスト調節活性をもつ医薬候補化合物として発展が期待できる。
一方、本課題の目標としたEDEMの酵素活性の検出とPtdGlc合成酵素の特定については、状況証拠に留まっており、更なる工夫が必要である。
|
| 今後の研究の推進方策 |
完成度の高い成果に結びつけるため、以下の方策を考えている。
・新規ミスフォールド糖タンパク質を用いて小胞体内代謝過程におけるグルコシル化の定量を行う。ミスフォールド型糖タンパク質のラセミ結晶化のための糖タンパク質合成を引き続きおこなう。Sep15とUGGTの結合の構造基盤をNMRなどを用いて明らかにする。また、EDEM活性の検出に向けた取り組みを行う。特に種々のPDIと共発現を行い、組み換えEDEMのマンノシダーゼ活性を検討する。新規の反応を種々糖鎖の合成や小胞体エンドマンノシダーゼ活性測定基質の合成につなげる。
・２系統のマンノース切断経路における責任酵素の同定に取り組む。また不良糖タンパク質分解に関与する新規エンドマンノシダーゼ活性について、機能の解明や活性本体の同定にも併せて取り組む。独自に開発した化合物を用いた、細胞機能の調節を検討する。
・ERp29とCNXの結合がどのような意義を持つかを解明するため、セルフダイマーを形成しないCNX変異体を作製する。また、発現タンパク質だけでなく、動物細胞におけるシャペロンダイマーの形成を評価していく。
・MindinをモデルにしてC-Man化タンパク質の品質管理に関わるシャペロン関連分子を探索する。そのIn vitroリフォールディング系を構築し、細胞由来マイクロソーム画分からC-Man化が関与するシャペロン関連分子を同定し、C-Man化糖修飾の作用機構を明らかにする。また、C-Man転移酵素と考えられるDPY-19L1/3遺伝子の発現制御とMindinの小胞体品質管理機構の解析も進める。
・標識ホスファチジン酸を合成し、PtdGlc の合成に関与するUGGT活性測定を図る。そのためにはより適切な検出系を模索する必要がある。LPGアナログの合成については、適切なデザインで、溶解性の問題をクリアしつつ高い活性を持つ化合物を探索する。
|
