| 研究課題/領域番号 |
16H06290
|
|---|
| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
|---|
研究代表者 |
伊藤 幸成 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 主任研究員 (80168385)
|
|---|
| 研究分担者 |
武田 陽一 立命館大学, 生命科学部, 准教授 (20423973)
松尾 一郎 群馬大学, 大学院理工学府, 教授 (40342852)
梶原 康宏 大阪大学, 理学研究科, 教授 (50275020)
迫野 昌文 富山大学, 学術研究部工学系, 准教授 (50391959)
井原 義人 和歌山県立医科大学, 医学部, 教授 (70263241)
戸谷 希一郎 成蹊大学, 理工学部, 教授 (80360593)
平林 義雄 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 客員主管研究員 (90106435)
山口 芳樹 東北医科薬科大学, 薬学部, 教授 (90323451)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2016-04-26 – 2021-03-31
|
| キーワード | 小胞体 / 糖タンパク質 / 糖脂質 / 生物機能 / 化学合成 |
|---|
| 研究実績の概要 |
・糖タンパク質フォールディング機構に関し、化学合成したシアル酸転移酵素を用いて従来のin vitro系および小胞体画分を用いる系で調べた。またUDP-5S-Glcや5-CF3 UDP-Glcを用いて、この過程に係るUGGTの寄与を調べた。更に、擬ラセミ結晶化に用いる糖タンパク質の量産体制を整えた。また小胞体内フォールディングサイクルに関わる酵素の発現や活性が代謝異常に応じて変化することを明らかにするとともに、分子シャペロンがクライアントタンパク質の2次構造の違いを識別することを明らかにした 。加えて、UGGTとSep15が安定な複合体を形成することを明らかにし、それらの結合部位を解析するために、光架橋性クロスリンカーを開発した。小胞体内エンドマンノシダーゼ活性に関する新たな知見を得ると共に、活性複合体がカルボキシルエステラーゼを含むことを見出した。エンドマンノシダーゼ解析用に蛍光性新規プローブを種々合成し、効率的な活性検出に結びつけた。小胞体に存在するERp29がカルネキシン（CNX）を二量化するリンカーとして働く一方、シャペロン機能は二量化により影響されないことが示された。
・UGGT特にUGGT2が、ホスファチジン酸(PA) をから糖脂質PtdGlcを合成する活性を有するという証拠を得ている。そこで種々のプローブを合成しその検証を行った。また、PtdGlc のリソ体(LPGlc) がGPR55の作動分子として働くことに基づき、認識機構の解明と、より創薬に適したアナログの開発を行った。
・タンパク質のC-Man化糖修飾はMindinの小胞体での酸化・還元フォールディングや分泌調節に関与し、その制御には小胞体分子シャペロンが協働して関与することが示唆された。また、C-Man-Trpモノマーの生成経路や、疾患病態マーカーとしての可能性を明らかにした。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
糖タンパク質品質管理機構の解明に関しては、化学合成を基盤とする研究が更に進んだ。特に、シアル酸転移酵素の合成により、糖鎖付加とフォールディングの関連を、酵素活性を指標として評価することが可能になるとともに、人工的に合成した酵素でシアリル化を行えることも実証できた。また、UDP-5S-Glc が有効なプローブになることが明らかになった。
UGGT1,2 およびSep15の大量発現を行い、電子顕微鏡観察が可能になった。複合体形成に伴う構造変化とこれにかかわる部位の同定を進めている。
小胞体エンドマンノシダーゼ活性の発見やPtdGlcを合成する活性をUGGT2に帰することができたのは、従来の概念を覆す成果であり、いずれも最終的な詰めの段階に入っている。エンドマンノシダーゼ解析用基質については、蛍光性置換基の導入方法を検討し有効な合成ルートが確立できた。新規なGPR55の制御分子の開発に向けてリソPtdGlcの類縁体を種々合成した。脂質部位の鎖長や構造修飾による活性への影響を広汎に調べる体制が整った。
本課題においてEDEM1, 2のマンノシダーゼ活性を検出することを目指して来たが、本年度になってEDEM3の発現に成功し、酵素活性について有望な知見を得ている。
ERp29がカルネキシン（CNX）を二量化するリンカーとして働くことを証明するとともに、構造予測を行った。また、モデルタンパク質を用いて複合体のシャペロン機能を調べた。
タンパク質のC-Man化については、Mindinの酸化・還元フォールディングや分泌に必要であることがわかった。C-Man-Trpがオートファジー経路を介した分解により一部は生成することがわかった。一方、ヒト疾患とC-Man-Trpとの関連についても解析を進めた、ヒト卵巣がん患者の血漿でC-Man-Trpが上昇することを見出し、疾患マーカーとしての可能性を提唱した。
|
| 今後の研究の推進方策 |
糖タンパク質品質管理機構の解析は、UDP-Glcアナログを利用した阻害実験系を活用し、これまでのデータと併せて早期に取りまとめを行って論文投稿に結びつける。糖タンパク質擬ラセミ体については、糖鎖化IL-8とD－型IL-8の結晶化を行う。構造生物学的手法および生化学的手法により、UGGT-Sep15複合体の立体構造・相互作用に関する知見を得る。基質糖タンパク質のモデルとしてはRNaseB-Man9を用い、UGGTとの相互作用をNMR法および電子顕微鏡で解析する。
各種EDEMの活性を選択的に阻害する糖類アナログの開発を進める。本年度EDEM3の発現系が確立できたことを受け、その酵素活性や特異性を解析するとともに、その相互作用タンパク質が与える影響を解析する。エンドマンノシダーゼに関しては、活性に関与するタンパク質の高発現株およびKO株の取得を行い、活性発現機構の解明に取り組む。また、活性解析に用いる基質の高感度化を進める。ERp29の機能については、動物細胞中におけるシャペロンダイマー形成を確認し、それが基質とするアンフォールドタンパク質を検索する。
本年度に引き続き、ホスファチジン酸 (PA) やPtdGlcに関連する化合物の合成を行う。これにより、PtdGlc生合成に係る酵素の証明を固めて論文発表を行う。また、LPGlcの誘導体を広汎に合成し、より有効なGPR55制御物質を開発する。
C-Man化タンパク質の酸化・還元フォールディングの分子機構について、C-Man付加野生型やC-Man欠損変異型のタンパク質を用いたin vitroリフォールディング実験系の解析を進める。また、細胞内C-Man-Trpレベル維持の分子機構について明らかにする。一方、C-Man-Trpの分析測定系を用いて、C-Man-Trpと悪性腫瘍疾患や代謝性疾患などとの関連についても解析を進める。
|
| 備考 |
富山大学 生体物質化学研究室（迫野研究室）http://www3.u-toyama.ac.jp/biochem/index.html
東北医科薬科大学 薬品物理化学教室（山口研究室）: http://www.tohoku-mpu.ac.jp/laboratory/yakuhinb/index.html
|
