| 研究課題/領域番号 |
16H06328
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
藤井 輝夫 東京大学, 生産技術研究所, 教授 (30251474)
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| 研究分担者 |
PLESSY Charles 国立研究開発法人理化学研究所, ライフサイエンス技術基盤研究センター, ユニットリーダー (60391984)
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| 研究期間 (年度) |
2016-05-31 – 2021-03-31
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| キーワード | 単一細胞解析 / トランスクリプトーム解析 / 誘電泳動 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、マイクロ流体アプローチによる単一細胞捕捉・解析デバイスとトランスクリプトーム解析手法とを組み合わせ、それらをより一層発展させることによって、１細胞トランスクリプトーム解析法の確立を目指すものである。具体的にはエレクトロアクティブマイクロウェルアレイ（Electroactive Microwell Array (EMA)）とnanoCAGE法とを融合することにより1細胞トランスクリプトーム解析法を実現し、具体的な応用として、子宮頸部上皮組織の解析について検討する計画である。
平成28年度は、ウェル構造を改良することにより細胞の高効率1細胞捕捉を実現した。1細胞解析を医療へ応用するためには、細胞数の限られた臨床検体を洩れずに捕捉し解析することが強く求められる。しかし、当初のEMAの細胞捕捉率はわずか10％程度であり、臨床検体解析への応用は困難であった。細胞捕捉率を向上するため、マイクロウェルをその機能の違いによって、捕捉用ウェルと反応用ウェルに分離し、細胞に作用する静電力・流れのシミュレーション結果に基づき、各ウェル構造の最適化を行った。その結果、95%の高効率細胞捕捉率の達成に成功した。本結果は高く評価され、Lab on a chipの表紙イメージとして採択・紹介された。
また、液状化細胞診法によって固定された細胞を効率良く捕捉するため、EMAの改良および実験条件の検討をおこなった。具体的には数値シミュレーションを用いてマイクロウェルのサイズを最適化するとともに、誘電泳動による捕捉条件（印加電圧、誘電泳動のためのバッファー、電極間距離など）を最適化した。その結果、low conductivityバッファー（4 mS/m以下）かつ10 kHz ~ 1 MHzの周波数の条件下で、固定された細胞を効率良く（90%以上）捕捉することに成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
従来のEMAを用いた実証実験の結果では、細胞捕捉率が当初予測より低く、臨床検体解析への応用は困難であった。そのため研究方式を見直し、流体シミュレーションを行い、それを反映したEMAの改良と細胞捕捉の実証実験を行う事とした。また、固定された細胞はその誘電率が生細胞とは大きく異なり、バッファー組成の検討が必要であるため、研究に若干の遅れが生じている。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成29年度は以下の項目について、検討を進める予定である。
【EMAの改良】子宮頸部上皮組織の臨床検体を効率良く捕捉するため、EMAの改良および実験条件を検討する。子宮頸部の上皮細胞は、扁平状の広い細胞質に小さな核をもった細胞であるため、EMAの改良 が必要である。具体的には、マイクロウェルの直径と電極間距離などの寸法を数値シミュレーションと細胞捕捉実験を通じて最適化を行う。また、マイクロビーズを用いたIndex配列導入法を検討するため、細胞とマイクロビーズなどの誘電体粒子の組み合わせを実現する新たなEMAを開発する。
【Index配列導入法の確立】Indexオリゴのリリースをコントロールするため、Indexオリゴを温度感応性のゲルへ担持させ、基板上にスポッティングしておく。スポッティング方法として今年度では超音波技術で液体を分注する超音波ディスペンサーを用いてIndexオリゴを担持した温度感応性のゲルを基板上にスポッティングする方法の検討を行う。また、スポッティング方法だけではなくIndex配列が結合されたマイクロビーズを利用する方法も検討する。具体的には誘電体粒子の組み合わせを実現する新たなEMAを開発する。
【picoCAGEプロトコルの開発】高分子へグラフトさせたindexオリゴを用いたCAGE反応の効率を確認するとともに、TSオリゴおよびRTプライマー濃度の最適化を行う。
【統合解析法の検討】 デバイス上での細胞内部質解析反応を確認するため、１細胞をEMAに捕捉し、標的遺伝子を増幅させるRT-PCRあるいは等温増幅方法などの反応をおこなう。これによって１細胞解析の反応とPDMSとの互換性を確認するとともに、１細胞を区画化するための条件を検討する。
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