1、生後成長期におけるCdc42の軟骨組織に対する機能解析 生後40日齢におけるCdc42fl/fl;Col2Cre-ERTマウスの大腿骨成長板における表現型の組織学的解析を行う。また、大腿骨成長板の増殖軟骨細胞層における細胞増殖について、組織切片作製後PCNAなどの増殖マーカー遺伝子の発現を免疫染色法およびBrdUの取り込みにより検討を行なった。同様に、肥大軟骨細胞層における細胞死をTUNEL染色法により検討を行なった。Cdc42fl/fl;Col2CreERTマウスの大腿骨成長板における軟骨分化に関与する遺伝子発現様式(Ⅱ型コラーゲン、Ⅹ型コラーゲン、マトリックスメタロプロテアーゼ、Sox9など)を定量的PCR法および組織切片を用いたin situ hybridization法により検討を行なった。 2、軟骨細胞において、Cdc42がどのような細胞外シグナルにより制御されているか(Cdc42シグナルの上流分子の同定) 様々な細胞外シグナル伝達物質(TGF-β、TNF-α)を生後1日齢の肋軟骨由来初代培養軟骨細胞に作用させた際のCdc42の活性化を、スクリーニングにより検討を行なった。また、軟骨分化に対する影響もスクリーニングによる検討を行なった。この時、Cdc42fl/fl;Col2Creマウス(胎生期より軟骨細胞でCdc42遺伝子が欠損しているマウス)の肋軟骨由来初代培養軟骨細胞に上記、様々な細胞外シグナル伝達物質を作用させ、同様に軟骨細胞の分化に対する検討を行った。軟骨細胞の分化は軟骨細胞分化マーカー遺伝子の発現様式(Ⅱ型コラーゲン、Ⅹ型コラーゲン、MMPsなど)を検討した。また、アルシアンブルー染色を行った。
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