研究課題
本研究は、シナプトネマ複合体構成因子SYCP3による減数分裂期組換えの制御機構の解明を目的とする。シナプトネマ複合体は、相同染色体の分配に必須な構造体であり、減数分裂期組換えの推進に重要な役割を果たす。しかし、その実体は明らかでない。これまでに報告者は、SYCP3はRAD51依存的な相同的対合反応を阻害するのに対し、DMC1依存的な相同的対合反応には影響を与えないことを見出している。そこで本年度は、この阻害効果の差異が、SYCP3との直接結合によるものかを検証するために、SYCP3とRAD51またはDMC1との相互作用解析を行った。解析の結果、SYCP3はRAD51に効率良く結合するのに対し、DMC１においては、その結合性が低いことを発見した。次に、SYCP3のRAD51との結合に重要なアミノ酸領域を同定することを試みた。その結果、RAD51の結合性が著しく低下したSYCP3変異体の作製に成功した。試験管内相同組換え試験系を用いた解析により、RAD51との結合性が著しく低下したSYCP3変異体は、RAD51依存的な相同対合反応を阻害しないことがわかった。以上のことから、SYCP3はRAD51に特異的に結合することで、RAD51依存的な相同的対合反応を阻害することが示唆された。減数分裂期組換えおいて、このようなRAD51依存的な組換え反応の抑制は、DMC１依存的な組換え反応の推進に重要であることが考えられる。さらに、SYCP3が細胞内における相同組換え反応に与える影響を解析するために、野生型とSYCP3およびSYCP3変異体をHeLa細胞に遺伝子導入し、安定発現株の樹立に成功した。また、SYCP3-RAD51複合体の高純度かつ大量精製し、結晶化ロボットによるスクリーニングを行った。
1: 当初の計画以上に進展している
本研究の目的は、シナプトネマ複合体構成因子SYCP3による減数分裂期組換えの制御機構を生化学的・細胞生物学的・構造生物学的手法によって明らかにすることである。本年度では、生化学的解析により、SYCP3のRAD51とDMC1に対する結合特異性を明らかにした。さらに、SYCP3のRAD51結合部位を特定し、そのアミノ酸残基がRAD51依存的な組換え反応の阻害に重要であることを発見した。したがって、当初計画していた生化学的解析は既に達成している。上述したように、本年度ではこれらの生化学的解析に加え、細胞生物学的解析および構造生物学的解析にも既に着手している。これらのことから、当初の計画以上に進展していると考える。
樹立した野生型SYCP3 またはSYCP3 変異体の安定発現株をもちいて、DR-GFP(Direct Repeat Green Fluorescent Protein)レポーターアッセイを行い、細胞内での相同組換え修復の効率を測定する。以上の解析により、RAD51との結合活性を失ったSYCP3が、細胞内でのRAD51の相同組換え活性に与える影響を細胞生物学的解析により明らかにする。SYCP3によるRAD51の相同組換え活性阻害の分子機構を明らかにするために、引き続きSYCP3-RAD51複合体の結晶構造解析を行う。SYCP3-RAD51複合体の結晶化には、RAD51との結合に重要なSYCP3の断片とRAD51をリンカーで融合させたタンパク質を用いる。高純度に精製したSYCP3-RAD51複合体を用いて、結晶化ロボットによるスクリーニングを行う。スクリーニングの結果をもとに、良質な単結晶が得られる結晶化条件を最適化する。得られた単結晶を用いて、大型放射光施設SPring-8またはフォトンファクトリーにて回折データを取得する。取得した回折データから、SYCP3-RAD51の立体構造を解明する。
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すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件、 オープンアクセス 2件) 学会発表 (2件) (うち国際学会 1件) 備考 (1件)
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