| 研究課題/領域番号 |
16J00424
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
石川 一也 京都大学, 理学研究科, 特別研究員(PD)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-22 – 2019-03-31
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| キーワード | 植物細胞 / 原形質連絡 / 植物ウイルス / 移行タンパク質 |
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| 研究実績の概要 |
実験計画では原形質連絡 (PD)上に細管状構造を形成する移行タンパク質を蛍光タンパク質標識し、誘導プロモーター制御下で発現する形質転換シロイヌナズナを作出し変異原処理を行う予定であった。しかし、形質転換したシロイヌナズナでは移行タンパク質がPDに局在する様子は観察されたものの、予想と異なり細管状構造を形成する様子が観察されなかった。複数種類のウイルスの移行タンパク質を形質転換し検討を行ったが、結果として細管状構造を安定的に形成する形質転換シロイヌナズナを得ることはできなかった。原因の究明には大幅な研究計画の遅延が予想されたため、研究計画を変更し、細管状構造を形成しない個体を用いて変異原処理を行い、移行タンパク質のPDへの局在が異常になる変異体を単離することとした。変異原処理を行った種子の次代について約200ラインの移行タンパク質のPDへの局在を確認したところ、PDがないとされる孔辺細胞において移行タンパク質がアグリゲーションを形成する変異体が単離された。
また実験計画では、誘導プロモーター制御下で、蛍光タンパク質標識された移行タンパク質を発現する形質転換BY-2培養細胞を作出する予定であった。しかし、BY-2培養細胞に形質転換を行い抗生物質で選抜を行ったが、得られた形質転換ラインは誘導をかけてもいずれも蛍光を発さなかった。おそらく、これらのBY-2細胞は形質転換されているにもかかわらず、蛍光タンパク質融合移行タンパク質を発現していないと考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ウイルス移行タンパク質が細管状構造を形成しなかったため、原形質連絡への局在性を指標とする変異体スクリーニングに変更を行った。また、BY-2培養細胞でウイルス移行タンパク質を発現する予定であったが計画通りに発現せず、発現ベクターの検討を行っている。
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| 今後の研究の推進方策 |
ウイルス移行タンパク質を発現させると孔辺細胞でアグリゲーションを形成する変異体が単離されたため、現在はこの変異体について原因遺伝子のマッピングを行っているところである。
またBY-2培養細胞でウイルス移行タンパク質が発現しない問題が生じている。現行の方法では、移行タンパク質を誘導プロモーター制御下で発現するBY-2培養細胞を作出するために、エストラジオールの添加により発現が誘導されるベクターを用いている。しかし、同ベクターを用いて形質転換を行った上述のシロイヌナズナにおいてもラインごとに発現パターンが大きく異なり、さらに同じライン内でも発現が不均一になる傾向が見られている。このため、エストラジオール誘導型のベクターに問題があると考え、アルコールや熱処理などにより一過的な発現誘導が可能なベクターの利用を現在検討している。
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