| 研究課題/領域番号 |
16J01859
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
竹川 宜宏 大阪大学, 理学研究科, 特別研究員(PD)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-22 – 2019-03-31
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| キーワード | べん毛 / べん毛モーター / 固定子 / 回転子 / メカノセンサー |
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| 研究実績の概要 |
Aquifex aeolicus由来の固定子タンパク質MotAについて、高い再現性で多様な結晶が得られた。SPring-8におけるX線回折実験により低分解能ではあるが回折像が得られている。今後、より条件を最適化していくことでMotAの高分解能構造決定に取り組む。
A. aeolicus由来のFliFの部分断片（FliF(58-213)）を、X線構造解析により2.3オングストロームの分解能で構造を決定した。同FliF断片が有する二つのドメイン（ドメインI、ドメインII）がそれぞれ、III型分泌装置構成因子PrgH内のドメインやPrgK/EscJ内のドメインと、構造的な類似性を示すことから、FliFのリングモデルを構築した。変異体解析から、構造中のジスルフィド結合の重要性や、β4-β5間のループ部分がFliFリング形成には影響しないがFlhAが集合するための相互作用部位であることを明らかにした。
Vibrio alginolyticusにおいて、べん毛モーター構成タンパク質の一つFliLが高粘性下でのモーター機能に必須であることを明らかにした。FliLのペリプラズムフラグメント（FliLp）の結晶構造をX線構造解析により2.1オングストローム、3.4オングストロームの分解能で決定した。FliLpは結晶中でリング状あるいはチューブ状の集合体を形成し、変異体解析からこのリング状の相互作用がFliLの機能のために重要であることを明らかにした。またFliLが固定子と相互作用するためには固定子が持つペリプラズムリンカーの長さが重要であることから、FliLが固定子を取り囲み、固定子-FliL複合体を形成して機能するモデルを提唱した。FliLは機械刺激応答因子として知られるSPFHファミリーと構造的な類似性を持ち、FliLが機械刺激依存的に固定子のイオンチャネル活性や活性化を制御する可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の予定通り、回転子タンパク質FliFの構造を元にした変異体解析から、FliFの構造-機能相関を明らかにすることに成功した。MotAに関してはナノディスクへの再構成・クライオ電子顕微鏡観察による構造解析が進展している。
また、新規にFliLのX線結晶構造解析に成功しており、構造を元にした変異体解析から、これまで予想されていなかった新規のべん毛モーター機能のモデルを提唱した。
これら以外に、べん毛の数を制御する因子SflAの細胞内局在を観察し、SflAが極局在タンパク質HubP依存的にべん毛基部に局在し、特に細胞質側に位置するのC末端側ドメインがべん毛形成を阻害する能力があることを示した。また、べん毛モーターの回転力を発生するためには固定子-回転子間に存在する荷電残基とべん毛モーターの回転方向の関係性について解析し、固定子内の荷電残基は両回転方向に等しく寄与すること、回転子の構造を不安定化させる変異により回転能力に偏りが生じることを明らかにするなど、研究の進捗として順調に進展しているといえる。
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| 今後の研究の推進方策 |
固定子タンパク質MotAの精製条件・結晶化条件・変異導入部位の最適化、高分解能X線回折測定を継続して行う。同時にナノディスクへの再構成・クライオ電子顕微鏡観察による異なるアプローチ方法による構造解析も継続する。得られた構造を元に変異体を作成し、過去に確立したキメラMotA大腸菌機能解析系を用いることで、べん毛モーター固定子の構造-機能相関を明らかにし、べん毛モーターの回転力発生機構・エネルギー変換機構に関して分子レベルでのメカニズムを解明する。
回転子タンパク質FliFに関しては、変異体作成を継続して行い、構造-機能相関をより詳細に明らかにする。
FliLに関しては現在すでに構造決定した極べん毛FliLに加えて側べん毛FliLの構造解析を行い、同時に構造を元に変異体を作成することで、現在提唱している新規モデルの信頼性をより確固たるものにする。
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