| 研究課題/領域番号 |
16J02319
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
井田 大貴 東北大学, 環境科学研究科, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-22 – 2019-03-31
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| キーワード | SICM / live cell imaging / cell penetrating peptide / electrochemistry |
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| 研究実績の概要 |
細胞膜は、細胞の内外を繋ぐ境界であり、表面に存在するサブマイクロメートルスケールの微小構造が細胞機能に密接に関与している。これらの微小構造の関わる細胞応答は、ナノスケール形状と局所的な生体分子濃度が相互に関連しながら連続的に変化している。従って、細胞機能の更なる理解には、局所的な形状と生体分子の変化を同時に計測する技術が不可欠である。しかし、従来法では時空間分解能と非侵襲計測を両立できる手法が存在せず、今までの手法と根本的に異なる測定技法が求められる。本研究では、申請者が開発した高速走査型イオンコンダクタンス顕微鏡を基盤技術として、局所形状と生体分子濃度を同時に測定できる高速ナノ電気化学顕微鏡の創成し、細胞の局所形状・化学物質測定による細胞機能の解明を目標とする。
本年度は、従来法では不可能な、細胞膜表面のナノスケール形状と膜近傍の蛍光標識試料の動態を同時測定可能な、高速走査型イオンコンダクタンス顕微鏡＋共焦点レーザー顕微鏡を完成させた。EMCCDのファンにより、測定部に振動が伝わるという課題があったが、共焦点ユニットの振動を完全に除去できる除震構造を開発し、Z方向の測定誤差を対策前の1/5以下に削減することに成功した。完成した高速走査型イオンコンダクタンス顕微鏡＋共焦点レーザー顕微鏡を用いた測定では、蛍光プローブで標識した膜透過性ペプチドの取り込みが表面形状に密接に関与することを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
平成28年度に高速走査型イオンコンダクタンス顕微鏡と共焦点レーザー顕微鏡を融合した装置を構築していたが、EMCCDのファンにより、走査型イオンコンダクタンス顕微鏡の測定部に振動が伝わるという課題が生じていた。生細胞の高空間分解能測定には、Z方向の測定誤差をさらに低減させる必要があり、本年度はまず除震機構の開発に着手した。開発した除震機構は、共焦点ユニットを測定系から切り離すことで、振動を完全に除去することができ、Z方向の誤差を100 nmから20 nmまで減少させることに成功した。本装置の実現は、計画調書作成時には想定できなかった進展であり、続いて報告する膜透過性ペプチドの取り込み様態の評価の様に、可視化できる試料の幅を大きく広げ、細胞膜の関わる生命現象の理解に大きく寄与することが期待できる。
続いて、構築した高速走査型イオンコンダクタンス顕微鏡＋共焦点レーザー顕微鏡を用いて膜透過性ペプチドの取り込み様態を評価した。HIV由来のTATペプチドやオクタアルギニンペプチドなどの、側鎖にアルギニンを多く含む膜透過性ペプチドは、細胞内に効率よく不透過性薬物を導入することが可能であり、ドラッグデリバリーなどへの応用が期待されている。しかし、最も重要な内在化の最終段階で、膜透過性ペプチドが脂質二重膜をどのように透過するか不明であった。構築した高速走査型イオンコンダクタンス顕微鏡＋共焦点レーザー顕微鏡は、膜透過性ペプチドの流入点での膜形状変化を観察でき、取り込み様態の解明に迫る知見を獲得できた。膜透過性ペプチドの研究は、装置開発が予定よりも進展したために測定対象とすることができ、計画調書作成時よりも大きく進展しているといえる。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度では、今年度に引き続き、開発した高速走査型イオンコンダクタンス顕微鏡＋共焦点レーザー顕微鏡を用い、膜透過性ペプチドを添加した際の形態変化の詳細解明に注力し、研究を行う。また、高速蛍光測定に向け、共焦点レーザー走査型顕微鏡のための高速XYピエゾステージを開発する。
今年度までに、蛍光標識した膜透過性ペプチドを観察しながら、流入点の形状変化を測定できる環境を整備した。次年度では、膜透過性ペプチドが流入した際の細胞膜変化を経時測定し、ピレンブチレートなどの細胞膜透過を促進する試薬や、膜曲率誘導ペプチド等の添加により、流入動態にどの様な差異が生じるかを定量的に評価する。
また、高速走査型イオンコンダクタンス顕微鏡は、プローブを垂直方向、サンプルを水平方向に制御しており、形状測定中にレーザーを固定照射するだけで、共焦点レーザー走査型顕微鏡測定が可能である。この方法で設計できる共焦点レーザー走査型顕微鏡は、低コストで構築でき、プローブ近傍のみにしかレーザーが当たらないため、蛍光像と形状像のプローブオーバープロットが簡便で、侵襲性が低い。しかし、測定の時間分解能は可動範囲と可動部の重量で決定される共振周波数（現在2.5 kHz）に由来するため、1分以内で変化するナノスケール形状と標識したペプチドの同時観察には、ステージの最適化が不可欠である。次年度では、可動部を極限まで切り詰め、走査型イオンコンダクタンス顕微鏡の測定範囲に合致した高速ステージを設計し、共振周波数10 kHzを目標に開発を行う。
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