| 研究課題/領域番号 |
16J02378
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
荒江 星拓 北海道大学, 大学院生命科学院, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-22 – 2019-03-31
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| キーワード | シロイヌナズナ / バイオマス / ポリA鎖 / 脱アデニル化酵素 / 転写後制御 / CCR4-NOT複合体 |
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| 研究実績の概要 |
ポリA鎖の除去（脱アデニル化）はmRNA分解の最初の段階である。真核生物に広く保存された脱アデニル化酵素複合体としてCCR4-NOT複合体があり，脱アデニル化酵素サブユニットとしてCCR4とCAF1を持っている。他の真核生物ではCCR4-NOT複合体と相互作用するRNA結合タンパク質が，CCR4とCAF1の標的mRNAの認識に働くことが知られている。シロイヌナズナの脱アデニル化酵素であるAtCCR4aおよびAtCCR4bの二重変異株ではエンドサイクルの亢進によってバイオマスの増大を示すが，その原因となる標的mRNAは明らかとなっていない。本研究ではAtCCR4a/b二重変異株が示すバイオマス増大の原因となる標的mRNAと，それを認識するRNA結合タンパク質を解明することを目的としている。
本年度は，AtCCR4a/bの相互作用因子のより包括的な探索を目指して，従来のIP/MS解析の実験系の改良を行った。その結果，AtCCR4-NOT複合体に含まれるもう一つの脱アデニル化酵素であるAtCAF1や複数のRNA結合タンパク質をAtCCR4a/bの相互作用因子候補として見出した。さらにシロイヌナズナに保存された複数のAtCAF1ファミリーについて，別のサブユニットとの相互作用を個別解析で調べた結果，一部のAtCAF1サブファミリーはAtCCR4a/bとは相互作用を示さないものの，複合体の足場タンパク質であるAtNOT1とは相互作用を示し，植物は異なる構成のCCR4-NOT複合体を持つことを示唆する結果を得た。また，AtCCR4a/bのバイオマス増大に関わる標的mRNAを同定するために，各mRNAのポリA鎖長を網羅的に同定するTAIL-seqの予備実験を実施し，実験条件の検討を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
申請者はこれまでにIP/MS解析によるAtCCR4a/bの相互作用因子の探索を行い，AtCCR4-NOT複合体の構成サブユニットの同定を進めてきた。従来のIP/MS解析ではいくつかの相互作用因子が同定されたが，一方で個別解析によって明らかとなった相互作用因子の一部は検出されなかった。本年度はより包括的な相互作用因子の探索を目指してIP/MS解析の実験条件の検討を行い，AtCCR4を過剰発現させる植物材料を従来のタバコからシロイヌナズナに変更してIP/MS解析を行った。その結果，新規の相互作用因子を含む多くの候補因子を見出すことに成功した。IP/MS解析から別の脱アデニル化酵素であるAtCAF1ファミリーの一部が同定されたことから，AtCAF1ファミリーと複合体サブユニットとの相互作用を個別に検証した結果，AtCAF1の3つのサブファミリーのうち2つが複合体の足場であるAtNOT1と，またそのうちの1つがAtCCR4a/bとも相互作用し，AtCCR4-NOT複合体にAtCAF1が含まれることが明らかとなった。さらに，複数のRNA結合タンパク質を新たに相互作用因子候補として見出した。現在これらのRNA結合タンパク質の欠損変異株および過剰発現株の作成を進めている。
TAIL-seqに関してはフランスの共同研究者との協議から，実験手法にさらなる工夫が必要であることが明らかとなり，本年度はより精度良く実験を行うための追加の予備実験を行った。一方で，現在までに解析に用いるRNAサンプルの調製を終えており，実験に用いる野生型株と二重変異株で核相に差が見られること，また既知の標的mRNAのポリA鎖長がAtCCR4a/b二重変異株では野生型株に比べて実際に長くなっていることを明らかにした。
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| 今後の研究の推進方策 |
改良した手法によるTAIL-seqを行い，野生型株とAtCCR4a/b二重変異株の網羅的なポリA鎖長の同定・比較解析によってAtCCR4a/bの未知の標的mRNAを明らかにする。得られた標的遺伝子に対して，発現パターンによるクラスタリングやGene Ontology解析を行うことで，エンドサイクルの亢進に関与すると予想される遺伝子を絞りこむ。また，翻訳効率の網羅解析であるRibo-seqやRNA蓄積量の網羅解析であるRNA-seqを合わせて行い，それらの結果と比較することでAtCCR4a/bによるポリA鎖長制御がいったいどのような転写後制御として機能しているのかを明らかにする。
一方で，IP/MS解析で新たに同定したRNA結合タンパク質の過剰発現株および欠損変異株を作出し，生重量，核相などの形質を調べることにより，バイオマスの増大に関わるRNA結合タンパク質を明らかにする。また，RNA結合タンパク質が認識するmRNAを明らかにするために，RNA免疫沈降法の実験系を確立にも取り組む。
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