| 研究課題/領域番号 |
16J03946
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| 研究機関 | 東京農工大学 |
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研究代表者 |
小嶋 由香 東京農工大学, 大学院連合農学研究科, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-22 – 2019-03-31
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| キーワード | 褐色腐朽菌 / 多糖モノオキシゲナーゼ / LPMO / 多糖吸着ドメイン / 新規ドメイン / Gloeophyllum trabeum |
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| 研究実績の概要 |
褐色腐朽菌と呼ばれる木材腐朽菌の一群は、我が国における最も主要な木造建築物の害菌である。褐色腐朽菌はセルロースとヘミセルロースを完全に分解することができるにも関わらず、他の糸状菌が有するセルロース分解に不可欠な多糖分解酵素や多糖吸着ドメインを欠損していることが明らかとなっている。そのため、褐色腐朽菌は酵素的な分解反応を補うためにフェントン反応を利用する非酵素的な分解反応を発達させてきたという説が提唱されている。しかしながら、これまでに私は褐色腐朽菌Gloeophyllum trabeumが新規の多糖吸着ドメインだと考えられる機能未知ドメインを保持していることを明らかにした。本研究では、この機能未知ドメインを保持するG. trabeum由来多糖モノオキシゲナーゼ（GtLPMO）の詳細な機能解析を目的として研究を行っている。
本年度は、GtLPMOの触媒ドメインの機能解析を実施した。GtLPMO遺伝子の転写産物をクローニングして全長配列を決定し、酵母菌Pichia pastorisを宿主とした組換え系で異種宿主発現させた。得られた組換え酵素を用いて活性測定を行った結果、本酵素はセルロースのみならずキシログルカンとグルコマンナンに対しても活性を有することが示された。生成物をMALDI-ToF-MSおよびHPAECにより解析した結果、本酵素はキシログルカンの側鎖の残基にかかわらず主鎖のβ1,4-グルコシド結合を切断することが明らかとなった。また、生成物としてグルコースのC1位とC4位を酸化した酸化物を生産することが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度はGtLPMOの触媒ドメインの機能解析を目的として研究を行ってきた。GtLPMO遺伝子の転写産物をクローニングして全長配列を決定し、得られた触媒ドメインのアミノ酸配列を既知のLPMOと比較した結果、既知のLPMOにおいて銅イオンの配位子として機能する３つのアミノ酸残基が本酵素でも保存されており、本酵素も活性中心の銅イオンを介した反応メカニズムを有することが示唆された。機能未知ドメインが付加されているGtLPMO-2を酵母菌Pichia pastorisを宿主とした組換え系で異種宿主発現させ、得られた組換えGtLPMO-2の活性測定を行った。GtLPMO-2をリン酸膨潤セルロース（PASC）に作用させ、その生成物をHPAECおよびMALDI-ToF-MSにより解析した結果、本酵素は生成物としてグルコースのC1位とC4位を酸化した酸化物を生産することが明らかとなった。種々の多糖類に対する分解特性を粘度測定により評価した結果、キシログルカンとグルコマンナンを基質とした場合に反応液の粘度低下が観察された。そこでそれらを基質としたときの生成物をHPAECおよびMALDI-ToF-MSにより解析した結果、特にキシログルカンを基質とした場合に多様な生成物が検出され、本酵素は側鎖の残基にかかわらず主鎖のβ1,4-グルコシド結合を切断することが示唆された。次に、木材中に存在する状態により近い基質としてリン酸膨潤セルロース（PASC）とキシログルカンを混合した基質を作成し、それに対する活性測定を行った。その結果、混合基質に対する活性はPASCあるいはキシログルカン単体よりも低くなり、本酵素は木材中ではセルロースミクロフィブリル同士を架橋するキシログルカン鎖に対して優先的に作用しているのではないかと考えられた。以上のように順調に本酵素の触媒ドメインの機能解析が進められた。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の研究ではGtLPMOの触媒ドメインに付加している機能未知ドメインの機能解析を行う予定である。本ドメインの多糖吸着能および金属結合能を評価するために、触媒ドメインの代わりに赤色蛍光タンパク質を機能未知ドメインに融合した融合タンパク質を作成し、それを用いて結合試験および吸着試験を行う。まず、赤色蛍光タンパク質と機能未知ドメインを融合させた酵母菌Pichia pastoris用の発現ベクターを構築する。これらのドメイン間はGtLPMO由来リンカー領域によって繋ぐが、リンカー領域の長さは何種類かを準備することで発現および機能解析に適した組換え酵素を得る。構築した発現ベクターを用いてP. pastorisの形質転換を行い、生産した組換え酵素を精製する。本ドメインはセルロース結合能を有すると考えられるため、まずはアビセルカラムによって精製を試みる。得られた組換え酵素を用いて、種々の金属イオンとの結合能を調査するため等温滴定型カロリメトリー（ITC）分析を実施する。具体的には、本ドメインと相同性のあるドメインが保持している亜鉛や、木材中に存在する銅、鉄、マンガン、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム、カリウムを用いる。バッファーチェンジを行い余分な金属を除去した後、得られた酵素をICP-MS分析に供して、本ドメインに吸着可能な金属元素を特定する。このようにして選抜された金属種を用いて、ITC分析を実施し、金属結合能を評価する。また、選抜した金属存在下で種々の多糖類に対する吸着試験を実施し、吸着が示された多糖類を用いてITC分析を実施する。また、多糖吸着能に関与することが予測されるアミノ酸残基に点変異を導入した組換え酵素を作成し、それらの組換え酵素の多糖吸着能を評価することで、吸着に関与するアミノ酸残基を全て特定する。金属結合に関与するアミノ酸残基についても同様の実験を実施する予定である。
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