|
本研究では“セレンテラジン(CTZ)”を発光基質に持つ発光酵素レニラルシフェラーゼ(RLuc)と人工発光酵素(ALuc)による高感度生物発光プローブの創製を目指した。まず発光強度の改善を狙い、約50種類以上のCTZ誘導体を合成、酵素との網羅的構造活性相関研究を行う事で、CTZの2位または6位炭素における置換基改変による生物発光特性への影響を詳細に調べた。更に新規基質と共同で開発した新規発光酵素を組み合わせる事で、新たなバイオアッセイ系の確立に成功した。
1.高輝度生物発光基質と革新的バイオアッセイ系の確立
発光酵素RLucの変異体(RLuc8.6)において、基質CTZの有用改変可能部位を初めて見出した。新規基質は市販品のブルーシフト基質DeepBlueCと比較すると約25倍の発光強度を持つ。更に、他の生物発光酵素ALucにおいても有意な発光を示し、これまでに金属イオンや細胞内タンパク質間相互作用解析等、様々なバイオアッセイ系への応用を行う事でその実用性を示してきた。これらの知見を基にCTZ誘導体20種類を新たに設計、発光酵素ALuc並びにRLucに各々特異的に反応する新規基質開発に着手した。これら新規基質とALucまたはRLucに基づくタンパク質間相互作用可視化プローブを組み合わせる事で、2種類のタンパク質間相互作用を同時に解析するデュアルレポーターアッセイ系の開発に初めて成功した。
2.超高輝度生物発光基質開発と生体イメージングへの応用
CTZとRLuc8のドッキングシミュレーション結果を基に20種のCTZ誘導体を開発、更なる高輝度化を図った。結果として生細胞においてDeepBlueCの約50倍の発光強度を持つ高輝度基質開発に成功した。新規基質は、高解像度での一細胞イメージングだけでなく、赤色発光酵素と組み合わせる事でCTZより高感度な生体内イメージングも可能にした。
|
