| 研究課題/領域番号 |
16J08094
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| 研究機関 | 大阪府立大学 |
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研究代表者 |
寺岡 佳晃 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-22 – 2019-03-31
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| キーワード | リポカリンタンパク質 / ジスルフィド結合 / L-PGDS / 円偏光二色性 / 立体構造 / 熱安定性 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は，リポカリンタンパク質に高度に保存されたジスルフィド（SS）結合による，βバレル構造の安定化機構の解明を目的とする。平成28年度は，SS結合の欠損したリポカリン型プロスタグランジンD合成酵素（L-PGDS）の発現系・精製法の構築，およびSS結合がL-PGDSの立体構造・安定性に与える影響の調査を主として行った。
【L-PGDSの発現系・精製法の構築】
受入研究室ですでに確立されていたL-PGDSの発現系・精製法を基に，SS結合欠損L-PGDSの発現・精製系を確立した。発現系には大腸菌を用い，精製法としてはglutathione S-transferaseタグによるアフィニティークロマトグラフィー，およびゲルろ過クロマトグラフィーを併用した。本系により培地1 Lあたり50 mg程度と高収量のSS結合欠損L-PGDSを得ることができた。これは以降の研究を遂行する上で十分な収量である。
【SS結合がL-PGDSの立体構造・安定性に与える影響の調査】
PBS（pH 7.4，37℃）においてL-PGDS，およびSS結合欠損L-PGDSの円偏光二色性（CD）測定を行ったところ，両タンパク質のCDスペクトルは，遠紫外領域において変化がなかった一方，近紫外領域においてわずかな変化が観察された。さらに熱変性CD測定を行ったところ，SS結合の欠損に伴いL-PGDSの変性中点温度は11℃低下することが明らかとなった。これらの結果から，生理的な条件において本SS結合が，L-PGDSの三次構造，および熱安定性の維持に重要な役割を担っていることが示された。
また上記の研究成果に関して，第16回 日本蛋白質科学会年会（福岡），第54回 日本生物物理学会年会（茨城），およびBio Medical Forum 2017（大阪）においてポスター形式での発表を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
SS結合欠損L-PGDSの発現系・精製法に関しては，先行研究を基にすることにより，障害なく短期間で構築することに成功した。また通常SS結合の欠損は，タンパク質の精製収量の低下につながることが多いが，本発現系・精製法では天然型のL-PGDSと大きく変わらない高収量のSS結合欠損L-PGDSを得ることができている。この成果から，SS結合欠損L-PGDSの試料準備過程が，本研究課題遂行のボトルネックとならないことが期待できる。
CDスペクトル測定，および熱変性CD測定に関しても，SS結合の欠損に伴うL-PGDSの凝集体形成が実験の障害となることが懸念されたが，緩衝溶液の組成やpH条件を検討することにより，精度よくデータを収集することができた。
また，次年度に予定している示差走査型熱量計（DSC）によるSS結合欠損L-PGDSの熱変性実験，および高磁場核磁気共鳴（NMR）装置（800 MHz）を用いたSS結合欠損L-PGDSの立体構造解析に関しても，本年度中に予備実験を実施済みである。
以上より，本研究課題はおおむね順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
CD測定により判明したSS結合の欠損に伴うL-PGDSの立体構造の変化，および熱安定性の低下に関して，それぞれ多次元NMR測定，およびDSC測定を用いてより詳細に調査を行う。
【多次元NMR測定】
L-PGDS，およびSS結合欠損L-PGDSの1H-15N heteronuclear single quantum coherence（HSQC）測定を行い，L-PGDSの立体構造においてSS結合の影響を受けている領域を同定する。また本測定を行うために必要な15Nラベル化L-PGDS，およびSS結合欠損L-PGDSを精製する。
【DSC測定】
DSC法によるL-PGDS，およびSS結合欠損L-PGDSの熱変性実験を行う。熱変性CD測定により得られた各タンパク質の変性中点温度とDSC測定の結果を比較する（再現性の確認）とともに，DSC測定により得られた熱変性過程の熱力学的パラメータから本SS結合のL-PGDSの熱安定性への影響を詳細に考察する。
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