| 研究課題/領域番号 |
16J08185
|
|---|
| 研究機関 | 東京海洋大学 |
|---|
研究代表者 |
小祝 敬一郎 東京海洋大学, 海洋科学技術研究科, 特別研究員(DC1)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2016-04-22 – 2019-03-31
|
| キーワード | 生体防御 / 血球細胞 / クルマエビ |
|---|
| 研究実績の概要 |
平成28年度は、貪食細胞の網羅的遺伝子発現解析を行うことを目的とし、培養法が確立されていないクルマエビ血球細胞において、貪食能を有する血球細胞の分離手法の開発を試みた。
クルマエビ血球細胞の培養方法が確立されていないため貪食細胞の分取はin vivoにて行った。すなわち、マイクロ磁気ビーズをクルマエビ体内に注射法により投与し、同個体から採血を行うことでマイクロ磁気ビーズを貪食した血球細胞（貪食細胞）の分取を行った。採血により得られた全血球細胞から磁力を用いて貪食細胞の分取を行い、蛍光顕微鏡およびFCMにより分取効率の確認を行った。その結果、全血球細胞では5-10%の血球細胞でビーズが確認されたのに対し、磁力分取後の血球細胞では60-70%の血球細胞でビーズが確認された。
貪食細胞特異的マーカー分子の探索を次世代シークエンサーにより行った。全血球細胞および磁力分取後の血球細胞からcDNAライブラリーを調整し、次世代シークエンサーMiseqによる網羅的遺伝子発現解析に供した。得られた塩基配列データをTrinityソフトウェアにて解析し、磁力分取後の血球細胞で多くの発現が予想される遺伝子を解析した。その結果、膜タンパク質と予測された遺伝子インテグリンを得ることができた。
次世代シークエンサーの結果より得られた膜タンパク質インテグリンの全長配列を、RACE法に得た。また、インテグリンのmRNAは全血球細胞および心臓、リンパ様器官で蓄積されていた。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
予定していたクルマエビの貪食細胞の分離を行い、次世代シークエンサーによる網羅的遺伝子発現解析を行った。さらにマーカー候補遺伝子を1つ選定し、発現解析を行った。当初の予定通りマーカー候補遺伝子を得ることができたため研究はおおむね順調に進展しているといえる。
|
| 今後の研究の推進方策 |
得られたマーカー候補遺伝子の組換えタンパク質を大腸菌にて作製し、ウサギに免疫することで抗血清を得る。得られた抗血清からIgGを精製し、免疫染色を行うことで全血球細胞中のマーカー遺伝子陽性細胞の比率を確認する。さらにMACSシステムを用いたマーカー遺伝子陽性細胞の単離法を開発し、発現遺伝子解析を試みる。
|
