| 研究課題/領域番号 |
16J09989
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
仁木 隆裕 東京大学, 大学院薬学系研究科(薬学部), 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-22 – 2019-03-31
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| キーワード | 逆行性輸送 / リサイクリングエンドソーム / コレラ毒素 / SMAP2 / クラスリン / AP-1 |
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| 研究実績の概要 |
逆行性輸送経路は、細胞外の物質や細胞膜に存在する膜タンパク質をゴルジ体・小胞体へと運ぶ細胞内輸送経路であり、組織・個体形成に重要であることが明らかにされてきている。しかしながら、逆行性輸送によって運搬されるタンパク質、およびその制御因子については不明な点が多く残されている。当研究室は、逆行性輸送がリサイクリングエンドソーム(RE)という細胞小器官を介することを世界に先駆けて発見し、さらにREに局在し逆行性輸送を制御する新規タンパク質を複数同定（Uchida et al. PNAS (2011), Matsudaira et al. PLoS One (2013), Matsudaira and Niki et al. J Cell Sci. (2015)）してきた。
今年度において、上記の論文で報告した、逆行性輸送制御因子であるSMAP2の機能未知ドメインに着目し、そのドメインと相互作用する分子を探索したところ、epsinRというクラスリン結合タンパク質がSMAP2と相互作用すること、epsinRがREに局在し、コレラ毒素のREからゴルジ体への逆行性輸送を制御すること等を明らかにした。これらの内容について、学会発表を行った。また、私は、コレラ毒素の逆行性輸送を制御する可能性のある膜貫通タンパク質の同定を目指し、FLAGタグを付与したコレラ毒素リコンビナントタンパク質を作製することに成功した。このリコンビナントタンパク質を細胞に添加し、膜透過性の架橋剤を用いて生細胞においてクロスリンクを行い、FLAGタグを介して免疫沈降を行ったところ、免疫沈降物にコレラ毒素添加時に特異的に見られるタンパク質が銀染色にて検出された。このタンパク質の中に、目的のコレラ毒素のエンドソーム受容体が含まれていることが期待され、現在、質量分析によって解析を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまでに報告したSMAP2/クラスリン/AP-1というREタンパク質の軸を基に、epsinRという新たな逆行性輸送制御因子を見つけることができた。また、免疫沈降が可能なタグを付与したコレラ毒素のリコンビナントタンパク質の作製に成功し、コレラ毒素依存的に細胞内で架橋されるタンパク質を検出することができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
質量分析で同定されたコレラ毒素結合タンパク質について、実際にそれらのタンパク質がコレラ毒素と結合し、その逆行性輸送を制御するかどうかを解析する。また、コレラ毒素の輸送制御機構をもとに、ラフト局在性タンパク質の細胞内輸送機構についても解析を行う。SMAP2/クラスリン/AP-1/epsinRという軸とREの関係についても更なる詳細な解析を行う。
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