| 研究課題/領域番号 |
16J10036
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| 研究機関 | 東京工業大学 |
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研究代表者 |
見原 翔子 東京工業大学, 生命理工学院, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-22 – 2019-03-31
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| キーワード | レドックス制御 / シアノバクテリア / チオレドキシン / 窒素固定 / 活性酸素 |
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| 研究実績の概要 |
レドックス制御は、光合成生物において光照射に応答した代謝の切り替えに重要である。光合成生物のレドックス制御に中心的な役割を果たすのは、チオレドキシン(Trx)とTrx reductase、それらのハイブリットタンパク質であるNADPH-Trx reductase C (NTRC)であると考えられている。緑色植物葉緑体のレドックス制御についてはすでに様々な研究が行われているが、その起源であるシアノバクテリアについては情報が乏しい。そこで、本研究では、窒素固定型シアノバクテリアAnabaena sp. PCC 7120 (Anabaena 7120)のレドックスネットワークの解明を目指して研究を行っている。本年度は以下の研究を行なった。
① レドックス制御におけるNTRCとTrx各サブタイプの標的タンパク質の選択性と分子機構の解明
Anabaena 7120が有する6種のTrxの組換え体を作製し、これらの組換え体タンパク質を抗原として抗体も作製した。また、窒素固定での還元力供給に重要なGlucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PDH)のレドックス制御機構を解明した。
② レドックスネットワークのin vivoでの作用機序と生理的重要性の解明
Anabaena 7120の遺伝子破壊株の作製、生長解析、顕微鏡観察：薬剤耐性カセットの挿入により、レドックスネットワークを構成するタンパク質の遺伝子破壊株を作製した。また、これらの破壊株について増殖解析および顕微鏡観察を行なった。一部の破壊株で生育不良や細胞形態の異常が見られた。また、①に述べたG6PDHの制御がin vivoでも行われていることを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
① レドックス制御におけるNTRCとTrx各サブタイプの標的タンパク質の選択性と分子機構の解明
G6PDHのレドックス制御については、レドックス制御に重要なシステイン残基やTrxの選択性を明らかにしたが、他の標的タンパク質に関する研究は進んでいない。組換え体Trxを用いたアフィニティークロマトグラフィーについては、現在準備中である。また、Trx以外の還元力供給系タンパク質の研究は、現在実行中である。
② レドックスネットワークのin vivoでの作用機序と生理的重要性の解明
各還元力伝達因子の破壊株を作製することに成功し、増殖解析も実施した。しかし、FTRの遺伝子の完全破壊はできなかった。G6PDHのレドックス制御の生理的重要性を明らかにした。Anabaena 7120の栄養細胞とヘテロシストではレドックス制御システムが異なることを示唆する結果を得た。
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| 今後の研究の推進方策 |
①レドックス制御におけるNTRCとTrx各サブタイプの標的タンパク質の選択性と分子機構の解明
引き続き、Trx reductaseの組換え体の作製を試みる。また、Trxアフィニティークロマトグラフィーによる標的タンパク質の探索を行ない、質量分析によって得られた標的タンパク質候補を同定する。標的タンパク質候補の組換え体を作製し、活性の生化学的測定法を確立する。続いて、実際にTrxから還元力が伝達するか否かを調べる。また、WTと各遺伝子破壊株のプロテオミクスにおいて、破壊株で発現量が顕著に上昇しているタンパク質の組換え体を作製し、同様の解析を行なう。
②レドックスネットワークのin vivoでの作用機序と生理的重要性の解明
FTR破壊株については、遺伝子抑制株として生理学解析を試みる。また、二重変異体の作製も試みる。
昨年度作製した一部の遺伝子破壊株では細胞形態に異常が見られた。この原因の一つとして、細胞内の活性酸素種の蓄積量の上昇が考えられるので、各Trxの欠損が抗酸化システムに与える影響を明らかにすることを目的として、シアノバクテリア細胞内の活性酸素種の蓄積量、抗酸化システムで作用する酵素活性など酸化ストレスに関わる生理パラメータの測定を行なう。また、細胞内のTrxの発現量を定量する。合わせて、これらのタンパク質が光照射による酸化還元応答を示すかを調べる。
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