| 研究課題/領域番号 |
16J10715
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
弘澤 萌 京都大学, 医学研究科, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-22 – 2019-03-31
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| キーワード | miRNAによるゲノム編集の制御 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、1. 細胞種特異的に発現するmicroRNA（miRNA）によるCRISPR-Cas9 systemの制御、2. CRISPR-Cas9 systemを利用したエピゲノムの多因子制御法の確立を目指している。
上記1については、当該研究室で開発されたmiRNA switch（miRNAによりタンパク質の発現が抑制される人工mRNA）を利用することによりほぼ達成された。よって、1についてを論文としてまとめ発表した。（そのため、当該年度の研究の成果は、昨年度の研究実績の概要と同じである。）本成果は、細胞種により活性の違うmiRNAを応用することで、細胞種に応じたゲノム編集の制御を可能とするため、将来的には医療応用にも役立つことが期待される。またmiRNAの状態に応じたゲノム編集ができるため、細胞状態の記録や機能改変など、基礎研究にも有益であると考えられる。
上記2については、まずは、遺伝子制御系の実験系の確立を行なった。具体的には、TRE（Tetracycline response element）を標的とし下流の遺伝子発現を制御する系の構築を試みた。TREの下流をhmAG1遺伝子としたベクターを構築し、HeLa細胞のゲノムに組み込んだ細胞株を作製した。dCas9（Cas9のヌクレアーゼ活性を欠損させた変異体）にVPR（転写活性化因子）を融合させたコントラストを用い、ガイド鎖の標的をTREにすることでhmAG1の発現が見られた。つまり、遺伝子制御系を評価するための実験系は一応確立できた。今後は、この実験系を利用し、遺伝子制御系の評価をするとともに、可能であれば（時間が許せば）、エピゲノム制御の系に移行していきたい。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
miRNA switchを用いることでCRISPR-Cas9 system（Cas9活性）を内在性のmiRNAにより制御することに成功した。そこで、本成果を論文として発表した。今回作製したシステムは、活性の高いmiRNAによりCas9の活性が下がる（ゲノム編集が起きなくなる）ものであった（OFF型）。そこで、人工遺伝子回路を利用することで、活性の高いmiRNAでゲノム編集が起きるシステムも開発した（ON型）。しかし、Cas9活性のリーク等の問題がみられたので現在は、これの改善を行なっている。前回より引き続き、EGFP遺伝子を安定発現しているHeLa細胞を用いてゲノム編集効率を評価している。
エピゲノム制御法を確立するために、まず、CRISPRa（dCas9に転写因子を融合させ標的遺伝子の発現を活性化させるシステム）が当該研究室でも可能かを検証した。そのためにTREの下流にhmAG１遺伝子を組み込んだベクターを作製した。このベクターによりCRISPRaが機能することを確認した後、これをゲノム上に組み込んだ細胞株を作製した。dCas9-VPRとTREを標的としたガイド鎖のプラスミドをこの細胞に導入したところhmAG1発現がみられたことよりCRISPRaは機能していると判断した。現段階は実験系の最適化（導入遺伝子量や解析日数の検討など）を実施している段階である。
論文として成果を発表できたこと遺伝子制御系が構築できたことを考慮し、現在までの進捗状況としては「おおむね順調に進展している」とした。
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| 今後の研究の推進方策 |
miRNAによるCRISPR-Cas9 systemの制御系においては、上記でも述べたが、ON型のシステムを改善する。改善を図ったシステムは、まず、EGFP遺伝子を安定発現しているHeLa細胞を用いて評価する（遺伝子切断を評価）。その後、2で作製した実験系（CRISPRa）による評価（遺伝子の発現制御の評価）を行う。そして、miRNAによるCRISPR-Cas9 systemの制御法は、1. 遺伝子の切断、2. 遺伝子の発現制御のどちらにも適用できることを示す。
作製した新規実験系の最適化をまずは行う。具体的には、導入遺伝子量や解析までの日数等を検討する。続いて、上記システムの評価系として使用していく。RNA導入（dCas9-VPR mRNAとガイド鎖）で遺伝子活性化ができるかどうかは未知なので、仮にRNA導入がうまくいかなかったら、DNA導入（プラスミドのdCas9-VPRとガイド鎖）で評価する。
上記評価系がうまくいった後、内在性の遺伝子を標的とする。この時は、VPR以外の因子（エピゲノム制御因子など）の使用も検討する。
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