| 研究課題/領域番号 |
16J11687
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| 研究機関 | 総合研究大学院大学 |
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研究代表者 |
福田 胡桃 総合研究大学院大学, 生命科学研究科, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-22 – 2019-03-31
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| キーワード | 卵子形成 / RNA結合タンパク質 / Dazl / 転写後翻訳調節 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は卵の発生に必須なRNA結合タンパク質Dazlの制御機構を解明し卵子形成にかかわる遺伝子発現調節機構を明らかにすることである。先行研究からDazlは生殖細胞において翻訳促進に働くRNA結合タンパク質であり、卵の一生を通じて必須の遺伝子であると考えられてきた。しかし、申請者は通説に反し、生後の卵母細胞ではDazlの発現は不必要であり、むしろ3’UTRを介してDAZL発現が抑制されることに重要な意味があることを明らかにした。これに加え、雌マウスにおいてDazlの3’UTRを除き、卵母細胞においてDAZLが過剰発現になると産子数の減少をもたらすことが今までのデータから示唆されていた。そこで
1. 卵母細胞におけるDazlの過剰発現は卵発達段階のどこで異常を生じ、産子数減少を引き起こすのか
2.Dazlの下流でどのようなメカニズムに異常が生じたのか
3. 3’UTRを介したDazlの転写後抑制は如何なる因子により引き起こされるのか
以上三点の疑問に答えることで、卵形成におけるmRNA発現調節の分子機構の一端を明らかにしてゆく予定で研究を進めている。特に本年度は前年度に挑んだ1つ目の課題である、産子数減少につながる異常が起こる時期を異なる手法でも確認し、裏付けを進めるとともに、2つ目の課題であるDazl下流で何が起きているのか、にも挑むことができた。具体的には少量のサンプルからRNAseqを行う手法を習得し、現在その解析を進めている。今後も残りの課題に挑むことで卵子形成に非常に重要な遺伝子であるDazlを中心とした遺伝子発現調節機構をより詳細に明らかにし、健全な卵子形成に関わるメカニズムの一端を解明していきたい。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
前年度にはDazlが生後も過剰に発現し続けた胚が発生段階のどこに異常をきたすのか詳細に調べた。結果、受精卵を培地中で発生させ観察することで、ブラストシストになるまでの着床前胚発生に異常が生じていることが分かった。本年度はこの結果に加え、実際に受精後3.5日目の胚を取り出し、ブラストシストへの発生率を調べた。すると生体内で発生を進めた着床前胚でも同様にブラストシストに至ることができない胚があり、おそらくこれが産子数減少の原因である事を確認した。
また、Dazlを強制発現するとその下流でどのような異常が起きているのかを明らかにするために少量サンプルからのRNAseq解析法を習得し、結果を得た。現在解析中であるがこの解析によりDazl下流でどのような異常が起き、産子数減少が引き起こされたのかを知る一助となる事が期待される。
更に、Dazlの転写後抑制は如何なる因子により引き起こされるのかについても解析を行った。実際にある候補遺伝子のノックアウトマウスではDazl発現が新生児の卵子でも維持されることが明らかとなり、この因子がDazlの上流で働いている可能性が考えられ、現在解析を進めている。
加えて、今年度は、今まで得ていたデータの再確認も行った。
特に、先行論文では生後にDazlをモルフォリーノを用いてノックダウンするとMⅡ卵において紡錘体形成に異常が出るという知見が知られていた。これに対し、申請者らはDazlを遺伝学的手法によりノックアウトしても生後卵子形成に異常がないという異なる結果を得ている。そこで、現在、申請者らの用いている系でMⅡ卵の紡錘体形成異常の有無を調べる等の実験を行っている。
今年度は当初に立てた３つの課題全てに着手することができただけでなく、今までのデータをより強固なものとし、着実に研究を前進させることができた。以上の理由から今年度の進捗はおおむね順調であると結論付けた。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は特に2つ目の課題である、Dazl下流で如何なる異常が生じたのかを調べるとともに3つ目の課題であるDazl抑制因子の探索に力を入れ、研究を推進する。
Dazlの下流でどのような異常が生じたのかを調べるために、申請者は前年度に少量の卵子からRNA-seqを行う手法を習得し、結果を得た。しかし、そのままでは十分に解析できる質ではなかったため、現在トリミング等を行い、比較解析に用いられるよう検討を行っている。これらの解析がうまくいけばDazlの下流でどのような因子が発現変動し、異常が起こるのかを知る一助となる。また、Dazl自体はRNA結合タンパク質として翻訳の促進に関わる遺伝子であるため、RNAではなく下流遺伝子のタンパク質発現に大きく影響している可能性がある。そこでRNA-seqによる網羅的なRNA発現解析に加えて、既知の下流因子のタンパク発現に影響があるか否かも調べる予定である。
更に、Dazlの転写後抑制は如何なる因子により引き起こされるのかについても引き続き解析を行う。現在までにDazlの転写後翻訳抑制は3’UTRを介して起こることが分かっており、申請者はDazl抑制因子をRNA結合タンパク質ではないかと仮定し、候補の探索を行ってきた。今までの結果からある遺伝子のノックアウトマウスではDazl発現が新生児の卵子でも維持されることが明らかとなり、この因子がDazlの上流で働いている可能性が考えられた。しかし、レポーターアッセイでは上手く系が動かず、詳細な解析を進める事ができなかった。今後は異なる培養細胞を用いる等といった工夫をすることによって上流因子の解析も進めてゆきたい。
これらの課題に挑むとともに今まで得た結果を確認し、裏付けていく実験を合わせて行うことで、Dazlを中心とした遺伝子発現ネットワークを解き明かし、如何に健全な卵子形成が行われていくのかを明らかにしたい。
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