Ｂ型肝炎ウイルス感染の蛍光可視化モデルの樹立と肝炎免疫応答機構の探索

2016 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 16J11897
• 研究機関: 国立研究開発法人国立国際医療研究センター
• 研究代表者: 犬塚 義 国立研究開発法人国立国際医療研究センター, ゲノム医科学プロジェクト, 特別研究員(PD)
• 研究期間 (年度): 2016-04-22 – 2019-03-31
• キーワード: 蛍光遺伝子 / HBV

研究実績の概要

下遠野研のNanoluc/HBV plasmidのNanolucを蛍光遺伝子に置き換えてまず蛍光遺伝子発現が確認されるか実験を始めた。蛍光遺伝子は輝度が最も高いものを2つ使用した（Azami-Green、Turbo-RFP）。Nanoluc直後のHBVのpreS1遺伝子領域のpromoterより上流の100bp程度を削り、蛍光遺伝子前後に制限酵素配列を付与して、PCR法とligationにより、蛍光遺伝子を挿入したHBV plasmidを2種類作成した（Azami-Green HBV, Turbo-RFP HBV）。HepG2細胞にそれぞれのplasmidを用いてtransfection(Lipofectamine 3000)したが、蛍光発色はなく、HBs抗原、HBe抗原のELISA測定法でHBVタンパクは検出されなかった。次に、In-Fusion HD cloning kitを用いて制限酵素配列のような、余分な配列を排除して蛍光遺伝子挿入を行い、新たに蛍光遺伝子挿入HBV plasmid（Azami-Green HBV, Turbo-RFP HBV）を作成した。HepG2細胞にそれらのplasmidをtransfection(Lipofectamine 3000)させると、Turbo-RFPでは20%程度の細胞に蛍光発色がみられたが、一方Azami-Greenではほんの3%以下程度の輝度の弱い蛍光発色しか確認されなかった。
次に、このTurbo-RFP挿入HBV(以下、RFP-HBV)を用いて感染実験を行った。HBVのε構造配列に変異を2か所挿入したHBV-⊿ε plasmidをHBVタンパクを補うため、co-transfectionさせた。14日間細胞培養し、7日間おきに上清を回収し、超遠心にて100倍濃縮して感染実験を行ったが、現状ではまだ粒子の形成は確認できていない。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

transfectionが成功したplasmidを作成できているため、理論上は粒子形成も望まれるが、HBVのカプシド内にHBV DNA(RT反応前のpregenomic RNA)が組み込まれるには、長さの調節がある程度必要な可能性がある。蛍光遺伝子は十分視覚的に確認できるため、あとは様々なplasmid長に振って感染実験を行っていくことが必要である。

今後の研究の推進方策

Turbo-RFP挿入HBV(以下、RFP-HBV)を用いて感染実験を行ったが、現状ではまだ粒子の形成は確認できていない。なお、上清中のHBs抗原は確認されており、transfectionは問題なく行えていると考える。今後はHBV/NLをコントロールとして感染実験を進めていき、上記のように様々なplasmid長をふって感染が可能な蛍光HBVを作成したい。また、それが不可能であれば新しいツールである、minicircle technologyを用いて新たな蛍光遺伝子挿入HBV作成を模索したいと考えている。

研究成果

• [雑誌論文] Evolution of multi-drug resistant HCV clones from pre-existing resistant-associated variants during direct-acting antiviral therapy determined by third-generation sequencing. (2017)
  • 著者名/発表者名: Takeda H, Ueda Y, Inuzuka T, Yamashita Y, Osaki Y, Nasu A, Umeda M, Takemura R, Seno H, Sekine A, Marusawa H.
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 7 ページ: 45605
  • DOI: 10.1038/srep45605
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Activation of TNF-α-AID axis and co-inhibitory signals in coordination with Th1-type immunity in a mouse model recapitulating hepatitis B. (2017)
  • 著者名/発表者名: Matsumoto T, Takahashi K, Inuzuka T, Kim SK, Kurosaki T, Kawakami S, Chiba T, Seno H, Marusawa H.
  • 雑誌名: Antiviral Research 巻: 139 ページ: 138-145
  • DOI: 10.1016/j.antiviral.2017.01.004.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Genetic basis of hepatitis virus-associated hepatocellular carcinoma: linkage between infection, inflammation, and tumorigenesis. (2017)
  • 著者名/発表者名: Takeda H, Takai A, Inuzuka T, Marusawa H.
  • 雑誌名: Journal of Gastroenterology 巻: 52 ページ: 26-38
  • DOI: 10.1007/s00535-016-1273-2.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Sonazoid-enhanced ultrasonography guidance improves the quality of pathological diagnosis in the biopsy of focal hepatic lesions. (2016)
  • 著者名/発表者名: Eso Y, Takai A, Takeda H, Matsumoto T, Lee M, Inuzuka T, Takahashi K, Ueda Y, Marusawa H, Seno H.
  • 雑誌名: European Journal of Gastroenterology and Hepatology 巻: 28 ページ: 1462-1467
  • 査読あり
• [雑誌論文] MSH2 Dysregulation Is Triggered by Proinflammatory Cytokine Stimulation and Is Associated with Liver Cancer Development. (2016)
  • 著者名/発表者名: Eso Y, Takai A, Matsumoto T, Inuzuka T, Horie T, Ono K, Uemoto S, Lee K, Edelmann W, Chiba T, Marusawa H.
  • 雑誌名: Cancer Research 巻: 76 ページ: 4383-93
  • DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-15-2926.
  • 査読あり
• [学会発表] The viral genomic characteristics of occult HBV infection and HBV reactivation (2016)
  • 著者名/発表者名: 犬塚 義
  • 学会等名: 臨床腫瘍学会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2016-07-28 – 2016-07-28
  • 招待講演
• [学会発表] 免疫抑制治療とHBV再活性化ウイルスゲノムの特徴 (2016)
  • 著者名/発表者名: 犬塚 義
  • 学会等名: 広島肝臓プロジェクト研究センター シンポジウム
  • 発表場所: 広島
  • 年月日: 2016-06-25 – 2016-06-25
• [学会発表] Reactivated virus from occult hepatitis B virus infection is characterized by amino acid changes in the major hydrophilic region of the S gene, (2016)
  • 著者名/発表者名: Inuzuka T, Marusawa H, Ueda Y, Seno H,
  • 学会等名: Digestive Diseasse Week 2016
  • 発表場所: San diego
  • 年月日: 2016-05-24 – 2016-05-24
  • 国際学会