| 研究課題/領域番号 |
16J40037
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
棟朝 亜理紗 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 特別研究員(RPD)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-22 – 2020-03-31
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| キーワード | KNDyニューロン / 弓状核 / κ-opioid receptor / GPR54 |
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| 研究実績の概要 |
畜産では優良な繁殖個体からできるだけたくさんの産子を得る必要がある。そのため、農学分野では長期的に見た生殖機能・繁殖機能の改良を行う必要がある。生殖系は視床下部-下垂体-性腺軸により、階層的に制御されているため、視床下部を中心とした中枢性生殖制御機構の解明は、これら改良に必要不可欠である。特に性腺刺激ホルモン放出ホルモン（GnRH）のパルス状分泌は精子形成や卵胞発育に関わるため、パルス状制御機構の解明は優良な繁殖個体の選別と生殖機能・繁殖機能の改良に直結する。
視床下部弓状核のキスペプチンニューロンは、GnRHパルス状分泌を制御するパルスジェネレーターの本体であると考えられている。この領域に存在するキスぺプチンニューロンは、GnRH分泌を直接促すキスペプチン（Kisspeptin）、パルス頻度を促進するニューロキニンB（Neurokinin B）、パルス頻度を抑制するダイノルフィン（Dynorphin）の3つの神経ペプチドを同一細胞内に発現するため、KNDyニューロンと呼ばれている。しかし、これらパルス状分泌を制御するKNDyニューロンが形成する神経回路網の詳細は未だ不明である。本研究では、これらKNDyニューロンが形成する神経回路網を詳細に同定することを最終目標としている。そこで、各神経ペプチド受容体のプロモーター制御下で神経トレーサー（WGA）を発現するアデノ随伴ウイルスベクターを作成し、導入することで各神経ペプチド受容体が発現する神経細胞とその投射経路の可視化を行うことを計画した。標的とする神経細胞に目的遺伝子を安定的に発現させる必要がある。そのため、各神経ペプチド受容体プロモーターをルシフェラーゼ発現ベクターに組込むことでレポーターコンストラクトを作成し、ルシフェラーゼプロモーターアッセイにより、特異性と活性の有無を検証した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究では、各神経ペプチド受容体のプロモーター制御下で神経トレーサー（WGA）を発現するアデノ随伴ウイルスベクターを作成し、導入することで各神経ペプチド受容体が発現する神経細胞とその投射経路の可視化を行うことを計画した。そのためには、標的とする神経細胞に目的遺伝子を安定的に発現させる必要がある。それゆえ、最初にベクターに組込むプロモーターの特異性と活性の有無を確認することとした。各神経ペプチド受容体プロモーターをルシフェラーゼ発現ベクターに組込むことでレポーターコンストラクトを作成し、ルシフェラーゼプロモーターアッセイにより、特異性と活性の有無を検証した。
各神経ペプチド受容体プロモーターをルシフェラーゼ発現ベクターに組み込みレポーターコンストラクトとして、次のコンストラクトを作成した。KOR遺伝子の開始コドンから上流2502 bpまたは499 bpの遺伝子配列およびGPR54遺伝子の開始コドンから上流1500 bp、1000 bp、499 bpの遺伝子配列をそれぞれルシフェラーゼ発現ベクターであるpGL4.11ベクターへ挿入した。これら作成したコンストラクトをKORとGPR54遺伝子発現陽性のP19C6細胞に導入し、プロモーターアッセイを行った。その結果、KORプロモーターとして2502 bp、GPR54プロモーターとして499 bpのプロモーター領域を導入したものが高ルシフェラーゼ活性を示した。一方、これらプロモーター領域に発現特異性が有るか検証するため、KORおよびGPR54遺伝子発現陰性のL6細胞を用いてルシフェラーゼアッセイを行った。その結果、P19C6細胞と同様の結果が得られた。
これらの研究成果は、おおむね順調に研究が進行しているといえる。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度は、KOR遺伝子の開始コドンから上流2502 bpまたは499 bpの遺伝子配列およびGPR54遺伝子の開始コドンから上流1500 bp、1000 bp、499 bpの遺伝子配列をそれぞれルシフェラーゼ発現ベクターであるpGL4.11ベクターへ挿入し、ルシフェラーゼプロモーターアッセイを行った。その結果、KORとGPR54遺伝子発現陽性P19C6細胞において、KORプロモーターとして2502 bp、GPR54プロモーターとして499 bpのプロモーター領域を導入したものが高ルシフェラーゼ活性を示した。しかし、KORおよびGPR54遺伝子発現陰性のL6細胞を用いたルシフェラーゼアッセイにおいても、P19C6細胞と同様の結果が得られた。これらの結果は、発現特異性を規定する部位が今回検討した遺伝子配列内に含まないことを意味している。それため、現在より長いプロモーター領域を持つコンストラクトを作成し、それらを用いることでプロモーターアッセイによる検証を行うことを計画している。また、アデノ随伴ウイルスは、挿入可能な遺伝子サイズが小さいため、長鎖のプロモーター領域を挿入することができない。そのため、WGA遺伝子発現ベクターの作成は、アデノ随伴ウイルスではなく、レンチウイルスを使用することに計画を変更した。今後は、特異性と活性を兼ね備えたプロモーター領域をプロモーターアッセイで探し出し、レンチウイルスベクターの作成を行いたいと考えている。
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