| 研究課題/領域番号 |
16J40037
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
棟朝 亜理紗 東京大学, 大学院農学生命科学研究科, 特別研究員(RPD)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-22 – 2020-03-31
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| キーワード | KNDyニューロン / 弓状核 / κオピオイド受容体 / GnRHパルス / 腹内側核 |
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| 研究実績の概要 |
生殖機能は視床下部－下垂体―性腺軸により、階層的に制御されている。生殖機能障害は、けっして末梢の生殖器官だけの問題ではない。病因の多くは、内分泌系を制御する中枢機構にある。それゆえ、生殖機能障害の理解や新たな治療法の開発には、生殖機能の中枢制御機構の解明が不可欠である。
卵胞発育、精子形成は、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（GnRH）のパルス状分泌により制御されている。近年、このGnRHパルス状分泌のパルスジェネレーターとして、視床下部弓状核にあるキスペプチンニューロンが着目されている。弓状核のキスペプチンニューロンは、GnRH分泌を直接促すキスペプチン、GnRHパルス分泌を促進するニューロキニンB、抑制するダイノルフィンの3つの神経ペプチドが同一細胞上に存在し、KNDyニューロンと呼ばれている。KNDyニューロンがGnRHパルスジェネレーターを形成し、GnRHパルス頻度の調節を行っていると考えられているが、未だ確証はない。キスペプチンの受容体であるGPR54はGnRHニューロンに、ニューロキニンBの受容体であるNK3RはKNDyニューロンに存在することが明らかとなっている。一方で、ダイノルフィンの受容体であるκ―オピオイド受容体（KOR）は局在が不明である。そのため、特にGnRHパルスを抑制するメカニズムが不明である。そこで、KORの局在およびKOR陽性ニューロン（KORニューロン）投射先を解明することとした。
KORは発現量が低いことと、他のGタンパク質共役型受容体と区別できる良い抗体がないことから、局在の解析が難しかった。そこで、KORプロモーター制御下で緑色蛍光タンパク質（GFP）と、順行性神経トレーサー（WGA）を発現するレンチウイルスベクターをラットの脳内に投与し、KORニューロンをタンパク質レベルで可視化し、KORニューロンの局在と投射先の解析をすることとした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究では、κオピオイド受容体（KOR）プロモーター制御下で緑色蛍光タンパク質（GFP）と順行性神経トレーサー（WGA）を発現するレンチウイルスベクターをラットの脳内に投与し、タンパク質レベルでKOR陽性ニューロン（KORニューロン）を可視化する。
特異性と高い活性を兼ね備えたラットのKORプロモーター領域を同定するため、プロモーターアッセイを行った。その結果、開始コドンより上流2502 bpの領域が高い活性と特異性を兼ね備えたプロモーター領域であった。同定したKORプロモーター領域制御下で緑色蛍光タンパク質（GFP）と順行性神経トレーサー（WGA）が発現するレンチウイルスベクターを作製した。レンチウイルスベクターを投与してからGFPとWGAが発現するまでの期間を調べるため、レンチウイルスを投与してから2週間または4週間後に灌流固定を行い、凍結切片を作製し、GFPの有無を確認した。GFPが確認できた個体に関して、WGAに対する免疫組織化学染色を行いWGAの発現を調べた。その結果、レンチウイルスを投与してから2週間後および4週間後ともにGFPとWGAの発現を確認することができた。この後の実験は、レンチウイルスベクターを投与してから2週間後に灌流固定を行った。レンチウイルスベクターは、KORの発現が報告されている視床下部背内側核（DMH）と腹内側核（DMH）、およびKNDyニューロンが発現している弓状核へ投与した。GFPの発現は、DMHとVMHで観察することができた。
GFPがKORニューロン特異的に発現しているかを確認するために、KOR遺伝子（Oprk1）のcRNAプローブの作製を行い、染色条件を検討中である。
これらの研究成果は、おおむね順調に研究が進行しているといえる。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度はレンチウイルスベクターをラットの脳内に投与してから2週間でGFPとWGAが発現することを明らかにした。このGFPがKORニューロン特異的に発現しているかを確認する必要があるため、現在KOR遺伝子（Oprk1）のcRNAプローブを作製し、in situハイブリダイゼーションの染色条件を検討中である。今後は、KORニューロン特異的にGFPとWGAが発現していることを確認し、GnRHパスル抑制に関わるKORニューロンの局在と投射先の解析を行う予定である。
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