研究課題
転写抑制因子Bach2 の発現は免疫系細胞で高いことが知られている。ヘムは、生命活動にとって必須の補欠分子族である。申請者らは、ヘムがBach2と直接結合し、DNA結合を阻害し、タンパク質分解を誘導することで、成熟B細胞から形質細胞への分化を促進することを示し、液性免疫応答を制御するというヘムの新たな役割を明らかにした。加えて申請者は、分光学的解析を中心とした解析を行うことで、Bach2が構造をとらない「天然変性タンパク質」であることを示し、複数のヘムがBach2の天然変性領域に結合し、Bach2の構造状態を変化させることを見いだした。しかしながら、ヘムがBach2タンパク質の構造状態を変化させる生理的意義は不明なままである。これまでに申請者は、Bach2の天然変性領域と直接結合する因子として、リン酸化酵素TBK1とDNAメチル化酵素を同定している。そこで本研究は、これらの因子の発見を手がかりに、「ヘムによる天然変性タンパク質Bach2の調節と生理学的意義」という、ヘムによる新たなタンパク質の制御機構を提唱すると共に、その生体での意義を追求することを目的とする。最終的には、免疫応答に必須な転写因子Bach2の制御機構を解明することを目指す。本研究が完成すれば、生体内でヘム濃度変化が液性免疫および自然免疫の重要なシグナル因子となることが証明される。このような成果は、ヘムの制御因子としての機能をさらに拡げるだけでなく、免疫制御の新しい制御因子を提唱することにもつながり、基礎生物学でも免疫学でも大きな貢献となる。
2: おおむね順調に進展している
1. TBK1によるBach2のリン酸化が機能へ及ぼす効果：細胞レベル、個体レベルでの機能評価＜Blimp-1 EGFPトランスジェニックマウスを用いた解析＞Bach2の直接標的遺伝子であるBlimp-1の遺伝子座の下流にEGFPを挿入した、Blimp-1 EGFPトランスジェニックマウスの脾臓B細胞をTBK1阻害剤存在化で培養し、EGFPの発現頻度をフローサイトメーター（FACS）で検討した。その結果、阻害剤存在化で形質細胞への分化頻度が亢進していることを示した。このことから、TBK1とBach2を介したBlimp-1の遺伝子発現制御が存在することが示唆された。＜レポーターアッセイ＞293T細胞にBach2及びTBK1の発現plasmidを導入し、レポーターアッセイを行った。その結果、Bach2の転写抑制活性は、TBK1の量依存的に不活性化することが示された。これらの結果から、TBK1の発現量が上昇すると、Bach2へのリン酸化が上昇することで、Bach2の転写抑制が解除されることが考えられた。＜TBK1によるBach2のリン酸化定量＞これまでに、大腸菌発現系Bach2及び昆虫細胞で発現させたTBK1を用い、アイソトープを使用したin vitro kinase assayを行い、「TBK1がBach2を直接リン酸化すること」を示している。そこで、このリン酸化の程度を定量的に評価するため、クロレラ培地を用いてBach2を発現させ、ヘム存在化・非存在化におけるTBK1によるリン酸化について、質量分析を用い定量的に検討した。その結果、ヘム存在化で、Bach2のリン酸化が亢進している傾向を示した。
前年度に引き続き、クロレラ培地を用い、同位体ラベルさせたBach2_331-520a.a.作成する。in vitroでリン酸化反応させ質量分析を行う。このとき同位体ラベルしていないBach2_331-520a.aについても同様な反応を行い、両者間でのシグナル強度を検討することで、リン酸化の定量を行う。＜TBK1によるBach2のリン酸化が機能へ及ぼす効果：細胞レベル、個体レベルでの機能評価＞Bach2ノックアウトマウスおよび野生型マウスの脾臓B細胞に対し、TBK1阻害剤の効果を検討しTBK1とBach2を介したBlimp-1の遺伝子発現制御の生理的意義について検討する。＜ヘム依存的に結合するユビキチンE3リガーゼの探索＞ヘムはBach2の分解を促進することから、ヘムがBach2と一定数結合し、リン酸化する場合に初めてユビキチン化E3リガーゼがBach2と結合することが考えられる。B細胞株でFLAG_Bach2_331-520a.a.とGFP_TBK1を共発現させる。2段階に分けて、両者の発現細胞を選択し培養する。ヘムはBach2の分解を促進することから、細胞回収直前にヘムを添加する。FLAG抗体で免疫沈降し質量分析を行う。この検討で、Bach2のリン酸化を認識するユビキチン化E3リガーゼを同定することができる。同定されたE3リガーゼについては、全長Bach2の免疫沈降実験により、Bach2複合体に存在することを確認する。
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The Journal of Biochemistry
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