研究課題
ヘムは、生命活動にとって必須の補欠分子族である。転写抑制因子Bach2 はB細胞およびT細胞で発現高いことがわかっている。申請者は、ヘムがBach2と直接結合し、成熟B細胞から形質細胞への分化を促進することを示し、液性免疫応答を制御することを見いだした。最近ではBach2が「天然変性タンパク質」であることを示し、複数のヘムがBach2の天然変性領域に結合し、Bach2の構造状態を変化させることがBach2の機能制御に重要である可能性を見いだした。さらに、Bach2に存在する２つのヘム結合様式（5配位、６配位ヘム結合）のうち、５配位ヘム結合がBach2の構造を安定化に関与することを明らかにした。更に、ヘムによるBach2の制御機構を解明するために、Bach2の複合体解析およびB細胞抽出液を用いたpull-down実験により、ヘム依存的にBach2と直接結合するリン酸化酵素を同定した。本年度は、野生型およびBach2ノックアウトマウス脾臓Ｂ細胞を用いて、Bach2がTBK1の遺伝子発現を直接制御していることを、定量PCR法およびクロマチン免疫沈降法により明らかにした。TBK1によるリン酸化の評価については、組換えタンパク質を用い、質量分析法により定量的に解析した。その結果、ヘムによってBach2のリン酸化が変化する傾向を示す結果が得られた。また、ヘム存在化における定量的なBach2の複合体解析を行い、ヘムがBach2の天然変性領域に結合することでBach2の構造状態が変化することを示した。そして、ヘム依存的に変化する因子の中にユビキチンE3リガーゼを同定した。
2: おおむね順調に進展している
これまでに申請者は、Bach2の天然変性領域と直接結合する因子として、リン酸化酵素TBK1を同定している。前年度までに、申請者は、Blimp-1 EGFPトランスジェニックマウスの脾臓B細胞を用いてTBK1阻害剤存在化で、EGFPの発現頻度を検討した。その結果、阻害剤存在化で形質細胞への分化頻度が低下することを示した。更にTBK1阻害剤がBach2のリン酸化を低下させることも示している。本年度は、ヘムによるTBK1によるBach2のリン酸化調節を定量的に検討とBach2-TBK1経路の生理学的意義として、Bach2がTBK1の遺伝子発現を直接制御することを、Bach2抗体を用いたクロマチン免疫沈降法により明らかにした。さらに、野生型およびbach2ノックアウトマウス脾臓B細胞を用いて、TBK1のmRNAの発現がBach2ノックアウトマウス細胞で亢進していることがわかった。また、ヘム依存的にBach2複合体が変化することを明らかにするために、SILAC法によるBach2複合体解析を行うことで、ヘムがBach2の天然変性領域を調節する意義を明らかにした。
前年度までに、Bach2の天然変性領域と直接結合するリン酸化酵素が、Bach2の直接標的遺伝子であること、ヘムによってTBK1によるBach2のリン酸化の頻度が変化する可能性を見いだしている。加えて、ヘム存在化における定量的なBach2複合体解析から、ヘム存在化でBach2複合体構成因子が変化することを見いだした。本年度は、①ヘムで調節されるBach2-TBK1相互作用の分子メカニズムを更に明らかにするために、時間変化におよびヘム濃度変化に伴うリン酸化反応をMALDI-TOF-MS（質量分析）を用いて検出し、引続き解析を行う。また、複合体解析で見いだされたユビキチン化酵素（E3リガーゼ）に関しては、免疫沈降実験、ノックダウン実験およびin vitroユビキチン化アッセイで、Bach2がユビキチン化されるか否かを検討する。最終的には、Bach2-TBK1経路に同定したE3リガーゼがどのように関与するかを免疫沈降実験により検証する。
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Biochemical Journal
巻: 475 ページ: 981-1002
10.1042/BCJ20170520
