単一細胞の網羅的遺伝子発現プロファイルの統合解析による乳がん組織不均一性の解明

2016 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 16J40231
• 研究機関: 国立研究開発法人国立がん研究センター
• 研究代表者: 富永 香菜 国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, 特別研究員(RPD)
• 研究期間 (年度): 2016-04-22 – 2019-03-31
• キーワード: 癌幹細胞 / １細胞解析

研究実績の概要

本研究では、乳がんを対象としてがん幹細胞をヒエラルキーの頂点としたがん組織の多様性、可塑性の実態の解明を目的とし、乳がん臨床検体を用いて１細胞レベルで網羅的な解析を行う。さらに、解析過程でがん幹細胞維持の鍵となる分子を同定し、がん幹細胞特異的に発現しているタンパク(がん幹細胞マーカー)や、がん治療薬の開発につながる分子標的を見出すことも視野に入れて研究を遂行している。
採用１年目では、乳がん臨床検体から極少数しか存在しないがん幹細胞を多く取得する方法を検討した。共同研究先の東大医科学研究所にてすでに収集済みの乳がん臨床検体１例（ER-/Prg-/HER2-；トリプルネガティブ）を免疫不全マウスに移植しPDXを作製した。組織片移植約２ヶ月経過後にできた腫瘍から組織粉砕と酵素処理によりがん細胞を単離し、EGF、basic FGF、B27を含む無血清培地中で培養を行った。培養１週間後、１００μｍ以上の細胞塊（スフェア）が複数観察されることを顕微鏡下で確認した。フィルター処理によりスフェアのみを取得し、酵素処理により細胞を分散した後、がん幹細胞マーカーをフローサイトメトリーにて解析した。その結果、接着細胞と比較して、スフェアの方ががん幹細胞様細胞が濃縮されることを確認した。以上の結果を踏まえて、今後は臨床検体のスフェア培養によりがん幹細胞を濃縮させた後、フローサイトメトリーにてがん幹細胞様細胞と非がん幹細胞に分けて1細胞解析を行い、RNA－seqによりがん幹細胞様細胞に特徴的な遺伝子発現を評価する予定である。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

これまでに生体外で細胞単離し培養することが困難な乳がん臨床検体でスフェアアッセイやマウスへ移植するpatient-derived xenograft（PDX）の系を立ち上げた。１細胞解析を行うための条件検討として腫瘍から取り出した細胞の内数％しか存在しないがん幹細胞をできるだけ多く確保する方法を確立や、生細胞のまま細胞を解析できる条件の検討に時間を要したが、おおむね順調に研究が進展したといえる。

今後の研究の推進方策

今後、国立がん研究センター研究所にてC１ single cell-prep system（Fluidigm）を用いた１細胞解析を行う予定にしている。予定では、C1にて96個の単一細胞を分離した後、逆転写、完全長cDNA合成、増幅まで行う。PicogreenによるcDNA濃度を測定後、酵素処理によるDNA断片化とシーケンスアダプター付加によるRNAライブラリーを作製する。磁気ビーズによりDNA精製を行い、Agilent 2100 バイオアナライザにより生成したDNAの品質チェックを行う。
サンプルは次世代シーケンサーを用いてRNA－seqを行う予定である。さらに、得られたデータの解析に取り組むのと並行して、上記と同様の手法を用いて別の検体（少なくとももう１検体）の解析も予定している。

研究成果

• [雑誌論文] An autocrine/paracrine circuit of growth differentiation factor (GDF) 15 has a role for maintenance of breast cancer stem-like cells. (2017)
  • 著者名/発表者名: Sasahara A., Tominaga K., Nishimura T., Yano M., Kiyokawa E., Noguchi M., Noguchi M., Kanauchi H., Ogawa T., Minato H., Tada K., Seto Y., Tojo A. and Gotoh N.
  • 雑誌名: Oncotarget 巻: 8 ページ: 24869-24881
  • DOI: 10.18632/oncotarget.15276.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Addiction to the IGF2-ID1-IGF2 circuit for maintenance of the breast cancer stem-like cells. (2017)
  • 著者名/発表者名: Tominaga K., Shimamura T., Kimura N., Murayama T., Matsubara D., Kanauchi K., Niida A., Shimizu S., Nishioka K., Tsuji E., Yano M., Sugano S., Shimono Y., Ishii H, Saya H., Mori M., Akashi K., Tada K., Ogawa T., Tojo A., Miyano S. and Gotoh N.
  • 雑誌名: Oncogene 巻: 36 ページ: 1276-1286
  • DOI: 10.1038/onc.2016.293.
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [学会発表] MICAL3 regulates symmetrical cell division of human breast cancer stem cells. (2016)
  • 著者名/発表者名: Tominaga K., Kanauchi H., Yano M., Ogawa T., Tada K., Tojo A. and Gotoh N.
  • 学会等名: 第39回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • 年月日: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [学会発表] MICAL3 regulates symmetrical cell division of human breast cancer stem cells. (2016)
  • 著者名/発表者名: Tominaga K., Kanauchi H., Yano M., Ogawa T., Tada K., Tojo A. and Gotoh N.
  • 学会等名: 第75回日本癌学会学術総会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • 年月日: 2016-10-06 – 2016-10-08
• [学会発表] Semaphorin/MICAL3/CRMP2 Regulates Tumor Initiating Activity in Human Breast Cancer Stem Cells. (2016)
  • 著者名/発表者名: Tominaga K., Kanauchi H., Yano M., Ogawa T., Tada K., Tojo A. and Gotoh N.
  • 学会等名: 第41回内藤コンファレンス、がんの多様性・可塑性と治療抵抗性
  • 発表場所: シャトレーゼ ガトーキングダム サッポロ（北海道札幌市）
  • 年月日: 2016-07-05 – 2016-07-08
• [学会発表] MICAL3 regulates symmetrical self-renewal in human breast cancer stem cells. (2016)
  • 著者名/発表者名: Tominaga K. and Gotoh N.
  • 学会等名: 第20回日本がん分子標的治療学会学術総会
  • 発表場所: 別府国際コンベンションセンター（大分県別府市）
  • 年月日: 2016-05-30 – 2016-06-01
• [学会発表] MICAL3 regulates tumor initiating activity in human breast cancer stem cells. (2016)
  • 著者名/発表者名: Tominaga K., Tada T., Tojo A. and Gotoh N.
  • 学会等名: 第14回幹細胞シンポジウム
  • 発表場所: 淡路夢舞台国際会議場（兵庫県淡路市）
  • 年月日: 2016-05-20 – 2016-05-21
• [図書] 細胞 2017年3月号 (2017)
  • 著者名/発表者名: 富永香菜、後藤典子
  • 総ページ数: 126-129
  • 出版者: ニューサイエンス社
• [図書] 細胞 2016年8月臨時増刊号 (2016)
  • 著者名/発表者名: 富永香菜、後藤典子
  • 総ページ数: 423-426
  • 出版者: ニューサイエンス社
• [備考] 国立がん研究センター研究所 がん分化制御解析分野
  • URL: http://www.nccri.ncc.go.jp/s007/index.html
• [備考] 東京大学医科学研究所 分子療法分野／がん分子標的研究グループ
  • URL: http://www.ims.u-tokyo.ac.jp/system-seimei/index.htm