| 研究課題/領域番号 |
16K00413
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
小塚 淳 国立研究開発法人理化学研究所, 生命シス テム研究センター, 研究員 (10432501)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 超解像 / スクリーニング / １分子計測 / ロボット |
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| 研究実績の概要 |
現代の生命科学において、各種疾病のメカニズムの解明など生命現象の根本的な理解には分子レベルでの研究アプローチが必須であり、超解像技術を駆使し、生体分子1個の動態や機能、構造を分析し、細胞／組織／個体の各階層で見られる現象の理解を目指す研究が近年広く行われている。今後、創薬における薬剤スクリーニングやゲノム多型における表現型解析、疾病の診断において生体分子の動態から定量される値を基に種々の判断を下し、分子メカニズムに即した詳細かつ正確、分析的な新しい医療技術へと発展させることが期待される。しかし、生体分子動態の物理・化学パラメータを高精度・高効率で求めるには技術的ブレークスルーが必要である。そこで本研究では、分子動態変化から薬効評価を行うハイスループットロボット顕微鏡開発を行う。また、超解像分子動態解析（細胞膜近傍の分子１個の動態（拡散や構造変化等）計測からレセプターの状態分布やその遷移レート、レセプター分子と下流のアダプター分子の動態相関など、様々な物理・化学パラメータを定量する手法）により定量される細胞内情報伝達や遺伝子発現、内在化、適応といった細胞機能の薬剤応答を指標とした新規スクリーニング（細胞内1分子スクリーニング）システムの構築を目指す。本年度は、開始年度に設計を行った長時間タイムラプス観測を可能にするインキュベータ型顕微鏡の実装を行った。また、上記顕微システム上で利用可能で網羅的解析を目的とした複数流路集積型のマイクロ流体デバイスの設計を行った。次に、本研究で提唱する細胞内1分子スクリーニング手法を実証するための１細胞・１分子計測系を立ち上げた。TLR4-TIRAPシグナル伝達計測系の論文が受理され、S1P走化性－分子動態相関計測系を使った走化性実験系、IL6刺激-形質細胞分化in vitro実験系の構築にあたった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまでのロボット顕微鏡の開発経験から、ロボット顕微鏡作成において、最も考慮すべき事は細胞培養環境の安定化である事が分かってきた。これまでに開発したロボット顕微鏡は、顕微鏡上にインキュベーターを構築するものであった。薬剤添加毎に薬剤添加ロボットがインキュベーターの扉を開閉するため、頻繁に細胞培養環境が大きく変動する影響で細胞の長期培養が困難であった。本年度は、上記問題を解決するため、既存インキュベーター内に顕微鏡、マイクロ流体デバイス、サンプルプレパレーションロボットを内蔵する形態のロボット顕微鏡を設計し、昨年度改造した既存インキュベーターに内蔵する顕微鏡ロボットの設計を行った。また、本研究で提唱する細胞内1分子スクリーニング手法を実証するための１細胞・１分子計測系のうち、TLR4-TIRAPシグナル伝達計測系の論文が受理された(Sato et.al. JACS, 2017)。高いバックグラウンドシグナルおよび蛍光標識系の限界のために、細胞内タンパク質の多色全反射蛍光顕微鏡法による単一分子イメージング（SMI）についてはほとんど報告されていない。上記論文では、近赤外蛍光を発し、変異型β-ラクタマーゼタグに特異的に結合するSi-ローダミンベースの標識プローブSiRcB（n）（n = 2,4,6）を開発した。オリゴエチレンオキシ基を親水性リンカーとして用いる我々の分子設計戦略は、プローブの細胞成分への非特異的結合を減少させた。 SiRcB4は、市販のHaloTagベースの赤色蛍光プローブと組み合わせて多色SMIを可能にし、自然免疫系に関与するTLR4およびそのアダプタータンパク質TIRAPの分子動力学を分析した。定量的特性およびそれらの動態の経時変化の統計分析は、リガンド刺激に応答するTLR4とTIRAPとの間のタンパク質 - タンパク質相互作用を明らかにした。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究のゴールは、開発したロボット顕微鏡を用いて、様々なサンプルを計測し、作業効率を評価すると共に、データベース環境、人工知能によるビックデータ解析の環境を構築することである。また、本課題で考案する１細胞・１分子スクリーニング法は、以下の手順に従う。１）１分子の動態（リガンドの結合解離、拡散、構造変化、分子間相互作用等）を計測し、２）生体分子の物理・化学パラメータ（拡散係数、結合解離定数、状態遷移レート等）を求める。３）網羅的解析からリガンドの導入による各パラメータの変化をデータベース化し、システム生物学的解析からリガンド種・濃度と機能（シグナル伝達、遺伝子発現、内在化、適応等）の相関を求める。４）その上でリガンドによる高次機能（極性形成、細胞運動、走性、貪食等）の制御理論を確立し、細胞の診断、創薬、治療に役立てる。
今後は、選定したスクリーニングのモデルケース実験系に対して、開発した１分子スクリーニング装置を用いて、網羅的１分子解析を行い、リガンド種・濃度と分子動態の相関のデータベースを構築する。作成したデータベースを活用し、入出力関係の数理モデルを構築、細胞の高次機能制御理論の確立を目指す。
具体的には、まず、正倒立顕微鏡ロボットを用いて、自動１分子計測の作業効率を見積もる。次に、正倒立顕微鏡ロボットのノウハウをインキュベーター型顕微鏡ロボットに移植し、長時間（数日～数週間）タイムラプス計測能力を向上させる。次に、TLR4-TIRAPシグナル伝達計測系、S1P走化性－分子動態相関計測系、IL6刺激-形質細胞分化in vitro実験系を対象とした網羅的解析を行い、リガンド刺激―分子動態相関データベースを構築する。人工知能を用いた自動分子認識システムおよび特徴抽出システム等を活用し、リガンド刺激による細胞動態（サイトカイン産生、走化性、分化）の制御理論の構築にあたる。
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