| 研究課題/領域番号 |
16K00541
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
保田 隆子 東京大学, 大学院新領域創成科学研究科, 特任准教授 (40450431)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | メダカ胚網膜 / 放射線損傷 / ミュラーグリア細胞 / 分化転換 / リプログラミング / SOX２ / アポトーシス / Ascl1a |
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| 研究実績の概要 |
我々はメダカ胚をモデル生物として、放射線照射により誘発される発達中の神経細胞への悪影響を調べてきた。発達中の脳は放射線に感受性が極めて高く、顕著なアポトーシスが誘発されるものの、それらが活性化したミクログリアによりほぼ完全に貪食・除去される一連の過程を明らかにしてきた。網膜は頭部の一部で系譜が同一であり、放射線照射後の頭部に誘発される影響を組織学的解析により調べる過程で、網膜にも顕著なアポトーシスが誘発されることが確認された。網膜に誘発されたアポトーシスは脳内と同様、活性化したミクログリアによって貪食・除去されることが判明した。さらに損傷した網膜の神経細胞が貪食・除去された後、その近傍に存在するミュラーグリア細胞が脱分化して神経細胞を産生できるようになり、増殖を再開して損傷した組織を修復することを免疫組織化学的解析により明らかにした。また、ミュラーグリア細胞が脱分化する際に必須なAscl1a遺伝子に着目しリアルタイムPCR法により発現解析を行ったところ、照射6時間後から顕著な発現上昇が認められ、照射1日後にはその発現は低下するが非照射よりも高い発現が継続していることを明らかにした。メダカの孵化期の網膜の損傷修復を調べた報告によると、メダカのミュラーグリア細胞は視細胞のみにしか修復能力を示さないとされている。本研究ではより発生の早い段階で放射線による損傷を誘発させたところ、ミュラーグリア細胞が他の網膜神経細胞も修復できる能力を有していることを明らかにした。このような発生段階によるミュラーグリア細胞の修復能力の差異は、網膜が損傷後、ミュラーグリア細胞のSOX2遺伝子の発現維持が発生の進行と共に低下することに一因があることを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
頭部で誘発されるアポトーシスが貪食除去される過程を、これまでin situハイブリダイゼーション法によりApoE, L-plastin遺伝子をプローブとして調べてきた。in situハイブリダイゼーション法は胚発生後期ではプローブの浸漬が極端に悪くなるため、正確なミクログリアの動態を把握することが困難である。そこで我々は、胚を生かしたままミクログリアの動態を観察できるApoE遺伝子のプロモーター領域下流にGFP蛍光タンパクを付加したコンストラクトを作製してメダカ胚の一細胞期にインジェクションを行い、トランスジェニックメダカを作出することに成功した。現在、放射線照射後に頭部で活性化するミクログリアの挙動を可視化することに成功している。
頭部と系譜を同一にする網膜にも顕著なアポトーシスが誘発されることが確認された。網膜に誘発されたアポトーシスは脳内と同様、活性化したミクログリアによって貪食・除去されることが判明した。さらに損傷した網膜の神経細胞が貪食・除去された後、その近傍に存在するミュラーグリア細胞が脱分化して神経細胞を産生できるようになり、増殖を再開して損傷した組織を修復することを免疫組織化学的解析により明らかにした。これまで、メダカの孵化期の網膜の損傷修復を調べた報告はあるが、より発生の早い時期に誘発されたメダカ網膜の損傷修復を調べた報告はない。胚発生初期のミュラーグリア細胞は、これまで報告されている視細胞以外の網膜神経細胞も修復できる能力を有している、という新しい知見を明らかにした。
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| 今後の研究の推進方策 |
放射線照射後の活性化したミクログリアの動態をライブイメージングできるトランスジェニックメダカとして、ApoE遺伝子の発現を可視化できる系の作出は成功した。ApoE遺伝子は、活性化したミクログリアの後期フェーズでのみ発現するため、活性化しミクログリアの初期フェーズでの動態を調べることは困難である。今後、活性化したミクログリアの初期フェーズで発現上昇するL-plastin遺伝子を可視化できるトランスジェニックメダカの作出を試みる。
活性化したミクログリアの動態の脳内での挙動は明らかにしてきたが、網膜での動態については詳細な解析があまり進んでいない。そこで網膜でのミクログリアの動態をライブイメージングし、組織の損傷修復へ寄与するミュラーグリア細胞の動態との相互関係を明らかにする。現在、哺乳類のミュラーグリア細胞の分化転換能はかなり限られたものであるため、網膜再生は多くの困難を伴う。本研究で見出される新たな知見が、哺乳類の網膜再生へ繋がることが期待される。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
放射線照射後の活性化したミクログリアの動態をライブイメージングできるトランスジェニックメダカとして、ApoE遺伝子の発現を可視化できる系の作出は成功した。ApoE遺伝子は、活性化したミクログリアの後期フェーズでのみ発現するため、活性化しミクログリアの初期フェーズでの動態を調べることは困難である。今後、活性化したミクログリアの初期フェーズで発現上昇するL-plastin遺伝子を可視化できるトランスジェニックメダカの作出を次年度へ持ち越しとなったため次年度へ繰り越しを行った。
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