| 研究課題/領域番号 |
16K00544
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
井倉 正枝 京都大学, 放射線生物研究センター, 研究員 (40535275)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | DNA損傷応答 / アセチル化 / TRRAP / ATM / TIP60 |
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| 研究実績の概要 |
我々は、TIP60によるH2AXのアセチル化が、DNA損傷応答シグナルの活性化に関与することを明らかにしてきたが、DNA損傷の現場でH2AXのアセチル化シグナルがいかなる機構で、誘導、維持、そして増幅されるのかについては、未だ明らかにされていない。本課題では、TIP60複合体の構成因子で、PI3 kinase ファミリーに属しながらもリン酸化活性のないTRRAPに着目し、DNA損傷領域におけるTIP60の集積とそれに伴うアセチル化シグナルの活性化メカニズムを明らかにすることが目的である。
本年度は、TRRAPのノックダウン細胞を用いて、TRRAPが、放射線照射後、TIP60及びNBS1などの損傷応答関連因子の損傷部位への集積にどのような影響を与えるのかを蛍光免疫組織学的解析およびmicro-irradiation (MI)とFRAPを組み合わせた手法により検討した。その結果、当初の予想通り、TIP60及びNBS1などのDNA損傷応答関連因子の集積は、TRRAP をノックダウンすることにより野生型と比較して、集積像が異なっていることが明らかになった。さらにMIとFRAPを用いた解析においても野生型と比較してTRRAPをノックダウンした細胞では、損傷領域に集積したGFP-TIP60およびNBS1-GFPのBleaching後のGFP回復のカイネティクスが野生型の細胞と比較して異なることを見出すことに成功した。生化学的解析では、H2AX-Flag-HAを発現させた細胞にノックダウンのためのTRRAPshRNAを誘導し、その細胞のクロマチン分画からH2AXを含むヌクレオソームの精製に成功した。TRRAPのH2AXのアセチル化及びH4のアセチル化への影響を生化学的に検討する準備が整った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は、TIP60ヒストンアセチル化酵素複合体の構成因子であるTRRAPに着目し、そのノックダウン細胞の作製を数種類の細胞で行い成功した。それらの細胞の中の一つを用いて、まずはTIP60及びNBS1などのDNA損傷応答関連因子のDNA損傷領域への集積を検討し、TRRAPは、これら因子のDNA損傷領域への集積に深く関与していることを明らかにした。また研究実績の項目でも記載したようにmicro-irradiationとFRAP解析を用いた実験も当初の予定通り進んでいる。しかしながら、TRRAPノックダウン細胞を用いたクロマチン免疫沈降に関しては、この実験に用いるTIP60の抗体が、枯渇しつつあり、新たな抗体作製が必要となり、この点が当初の予定よりやや遅れている。全体としては、おおむね順調に進展していると言える。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、先にも述べたようにTIP60抗体の作製を行い、当初予定していたTRRAPノックダウン細胞を用いたクロマチン免疫沈降実験を行う。TRRAPのTIP60およびNBS1の損傷領域への集積への影響についての蛍光免疫組織学的解析から得られた実験結果をこの実験により検証する。さらにTRRAPとDNA損傷領域でのヒストンH2AXのアセチル化およびリン酸化、H4のアセチル化、との関係について生化学的に検討する。この結果を基にヒストン化学修飾の抗体を用いたクロマチン免疫沈降法によって検証する。またDNA損傷領域でNBS1に対してTRRAPとATMあるいはDNA-PKcsが競合関係にあるかどうかについては、同じくクロマチン免疫沈降法およびmicro-irradiationを用いたイメージング解析を駆使して検証する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度予定していた研究計画の中で、TIP60の抗体を用いる実験があるが、予定した以上に使用がかさみ、新たな抗体を作製する必要が出てきた。特にクロマチン免疫沈降の実験では、市販のTIP60の抗体では良好な結果を得ることができないことから、自前での作製が必要である。また本課題を遂行する中で、TRRAPが化学修飾を受ける可能性が見出され、その修飾抗体を作製する必要が出てきた。これらの事情により次年度の使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
TIP60の抗体およびTRRAPの修飾抗体の作製に使用する予定である。
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