| 研究課題/領域番号 |
16K00548
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
蔵重 智美 長崎大学, 原爆後障害医療研究所, 助教 (60568955)
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| 研究分担者 |
永山 雄二 長崎大学, 原爆後障害医療研究所, 教授 (30274632)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | UV / 放射線 / RET/PTC / ジスルフィド結合 |
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| 研究実績の概要 |
「放射線被ばくで生じたRET/PTCは内部被ばくの場合、継続的な被ばくによりROS産生・レドックス反応が持続し、RET/PTCがさらに持続的に活性化される」という仮説の証明
(1) CHO/RET PTC1細胞の作製
本研究で用いる予定であったPCCL3細胞（ラット正常甲状腺細胞）よりも増殖が早く実験の効率がよいCHO（Chinese Hamster Ovary）細胞にレンチウイルスを用いてRET/PTC1遺伝子導入を試みたが上手くいかず、その後レトロウイルスに切り替えクローニング方法もIn-fusion法に変更した。この方法で遺伝子導入した細胞をG418(ネオマイシン)でセレクションを行い、ウエスタンブロットにてV5 tagの発現を確認できたことからRET/PTC1遺伝子導入完了とみなし、これをCHO/RETPTC1細胞とした。
(2) 放射線照射によるRET/PTC1の異常活性化の確認
以前の報告でRET/PTC1の活性化を誘導した紫外線（UV）200J/cm2照射またはX線10Gy照射でCHO/RETPTC1細胞が異常活性化を起こすか否かを下流のMAPKの発現により確認した。基礎検討の結果としてCHO細胞へのUVあるいはX線照射60分後、p-ERKの発現の増加を認めたもののp-p38、p-JNKについては抗体の反応性の問題からか検出が不可能であったためCHO細胞を用いた検討を断念し、H-Tori（ヒト正常甲状腺）細胞を用いることにした。基礎検討の結果ではH-Tori細胞へのUVあるいはX線照射10分後、p-p38の発現の増加を認めた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
遺伝子導入に用いるウイルスの選定やクローニング法の検討に時間を要したためCHO/RET PTC1細胞の作製完了までに遅れが生じた。また、基礎検討に用いた細胞の変更による遅れも大きい。さらに作製したCHO/RET PTC1細胞を用いた実験ではウエスタンブロットにおいていくつかの抗体の反応性の問題から検出が不可能であったために、細胞を変更して実験をやり直す結果となり、遅れが生じた。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在とCHO/RET PTC1細胞作製した際と同様の方法でH-Tori細胞へのRET/PTC1遺伝子の導入に着手している。今後はH-Tori/RETPTC1細胞を確立し、放射線内・外照射によるRET/PTC1のさらなる活性化を証明していきたい。また初年度の実験計画に大幅な遅れが生じたため、今後はin vitroの実験に的を絞って検討を行う予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初の研究計画に対して進捗に遅れが生じており、計画では使用予定であった試薬などの購入が一部なされていなかったために次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成28年度の研究計画で実行できなかった項目で使用を予定している消耗品の購入に使用する。
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