| 研究課題/領域番号 |
16K00549
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| 研究機関 | 金沢医科大学 |
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研究代表者 |
橋本 光正 金沢医科大学, 一般教育機構, 准教授 (70293975)
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| 研究分担者 |
奥田 光一 金沢医科大学, 一般教育機構, 講師 (60639938)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | DNA損傷 / DNA修復 / アポトーシス死 / X線 / ミトコンドリア膜電位 / 53BP1 / 細胞周期チェックポイント機構 / アクチン重合核化因子 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、X線照射後の細胞をタイムラプスレーザー共焦点顕微鏡で動画撮影し、最終的に生存あるいはアポトーシス死に移行した細胞の照射以降の 状態を、時間をさかのぼって観察した。本研究は、DNA損傷部位に集積する53BP1のフォーカスの数、形態、容積を指標に、運命の決定を下す時期と要因(DNA損傷数なのか、損傷の質なのか、損傷を受けた細胞周期なのかなど)を明らかにすることを目的としている。 結果、72-96時間の範囲が細胞の修復完了かアポトーシス死かの分枝点であることを見出した。そこでこの範囲に着目して、アポトーシス志向細胞について調べたところ、(1)DNA損傷が増加すること、(2)残存ATMの脱リン酸化が起こること、(3)ミトコンドリア膜電位が不安定化すること、(4)核膜構造が脆弱化すること、(5)Arp2、Arp3アクチン重合核化因子がFociを形成すること、Thymosin β4、Profilinなどのアクチン結合タンパクの発現増加を見出した。次に生存志向細胞について調べたところ、(1)細胞周期チェックポイント機構が強く機能し、G2期停止時間が長いこと、(2)G1期停止時間には依存しないこと、(3)ミトコンドリア膜電位が高い値で安定化した後、96時間を目処に急激に低下すること、を見出した。
BrdUの取り込みで調べたところ、24-72時間の範囲でBrdUの取り込みが多い細胞は、上述したアポトーシス志向細胞の特徴を見いだすことができた。BrdUの取り込みが少ない細胞は、その逆に生存志向細胞の特徴を見いだすことができた。
DNA修復タンパクATM、53BP1の免疫染色の結果、72-96時間の範囲で残存するフォーカスは24時間以内にある様なフォーカスと異なり、大きくなる傾向があった。また53BP1Nuclear Bodyを調べたところ、これらは残存もしくは減少する傾向にあった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
DNA損傷を与えてから、細胞死に至るまでの動画データの解析に、想定以上の時間が必要となった。また本研究課題の現象解析に一番使用頻度の高かったフローサイトメトリーの故障により、その実験データを取得するのに時間を必要とした。研究課題の仮説モデルを再構築した。その結果、新たに調べることが必要な核内タンパク質が出てきた。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在までに取得した画像を解析し，統計処理した後、仮説モデルを再構築した。その結果、核内のアクチンおよび各種アクチン関連タンパクに、SWI-SNF、SWR、INO80などのクロマチン再構成に関するタンパクやNuA4 HATなどのヒストン修飾酵素複合体の、複合体構成要素となり、クロマチンの構造変換に関与している可能性があるので、これらについて新しく構築した仮説にフィットするかどうか検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究の遅れによって生じた。この助成金は研究成果の発表と報告に使用する。残金291,441円を研究成果の発表、論文出版、英文添削の費用とする予定である。
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