研究課題
当該年度は、これまで行ってきたFRET（蛍光共鳴エネルギー移動）による放射線DNA損傷の局在性評価について、追加データをとるための照射、分析実験、及び解析を行った。FRETの大きさは、我々がすでに報告した同種蛍光分子間で生じるFRET（homo-FRET）を活用し(Akamatsu, K., Anal.Biochem.536 (2017) 78-89)、蛍光異方性<r>を測定することによって求めた。照射試料はこれまでと同じく、pUC19プラスミドDNA（細胞内模擬条件下（~10mg/mL 0.2M TrisHCl(pH 7.5)）で照射）を用いた。また、用いる重粒子線に関して、これまでのヘリウム、炭素、鉄イオンに加えて、それらよりさらにLET（線エネルギー付与）が高いネオン、アルゴンを利用できるようになったので、これらによる実験も行った。各々一回しか照射実験ができていないが、従来のヘリウム、炭素、鉄イオンと比較して、損傷の局在性が高いことを示唆する結果が得られた。今後さらに追試等を行い、結果をまとめて論文化する予定である。また、前年度から進めている複雑DSB（クラスター損傷の一種で、二本鎖切断部位の近傍にさらに別の損傷があるような損傷）のFRETによる分析を行うため、プラスミドの放射線照射によって生じたform IIIの分取を行った。さらに、クラスターDNA損傷（損傷が局在化した部位）の可視化を目指して、全反射照明蛍光顕微鏡TIRFの自作を始めた。概ね組み上げることができた。
3: やや遅れている
プラスミドDNAを用いたFRET法によるクラスターDNA損傷の評価は、概ね予定通りに進んでいるが、当該年度よりこれまでよりLETが高いネオン、アルゴンイオンビームの利用が可能になったので、これらの実験を新規に始めた。また、細胞内ゲノムに生じたクラスター損傷の可視化については、それに必要なTIRFの立ち上げを進めている。
・ネオン、アルゴンイオンビームによって生じるDNA損傷の局在性をFRET法で調べ結果をまとめる。・クラスター損傷の一種である複雑DSBの特徴をFRET法を活用して調べる。・TIRFの立ち上げを完了し、DNA中のクラスター損傷を可視化する方法を確立する。
TIRFに関して予定より部品の組立調整に時間がかかった。次年度にかけて立ち上げを行う。次年度にDNAオリゴマー及び放射線照射DNAを用いて、TIRFでのDNA損傷の可視化を行う予定である。使用予定額の内訳は、DNAオリゴマー：50万円、試薬類：32万円、出張費（照射実験、6回）：30万円、学会旅費・参加費：10万円である。
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すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (3件) (うち国際学会 2件)
International Journal of Molecular Sciences
巻: 21 ページ: 1701(1-13)
10.3390/ijms21051701
