| 研究課題/領域番号 |
16K00589
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| 研究機関 | 宮崎大学 |
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研究代表者 |
宮武 宗利 宮崎大学, 工学部, 助教 (40315354)
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| 研究分担者 |
塩盛 弘一郎 宮崎大学, 工学部, 教授 (80235506)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 環境技術 / ヒ素の無毒化 / 酵素工学 |
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| 研究実績の概要 |
直接in vitroでヒ素メチル基転移酵素（arsM）を使ってメチル化反応を効率的に行うには、まずメチル化活性の高いarsMの溶液を調製する必要がある。現在、申請者はヒ素メチル化細菌Cellulomonas sp. K63株が保有するarsM遺伝子の塩基配列を明らかにしている。平成28年度までにarsM遺伝子を持つ組み換えプラスミドを作製し、FLAGタンパク質発現システムを使用して、宿主大腸菌DH5αでarsM遺伝子の発現を試みた。電気泳動により、酵素タンパク質の産生を確認した。平成29年度では、組み換え体大腸菌が産生したarsMを抗FLAGアフィニティーゲルを用いて精製した。精製条件を検討した結果、1回の操作で回収できる酵素たんぱく質の量は少ないが、ゲルを再生し何度も精製操作を繰り返すことで回収量を上げることができた。精製した酵素の活性については、メチルトランスフェラーゼ活性測定キットで測定した。その結果、酵素反応において、酵素溶液に含まれる塩が反応を阻害していることが分かった。
平成28年度に新たに宮崎県内の土壌から分離したヒ素メチル化細菌Bordetella petrii KC42株のarsMについて、K63株と同様にarsM遺伝子を持つ組み換えプラスミドを作製した。
本研究では、実用化への可能性を探るため、調製されたarsMを直接、固定化担体に固定化し連続してメチル化反応を行えるかどうかを検証することにしている。平成29年度は酵素内包多孔質マイクロカプセル法について実験を実施した。最初はarsMを固定化するのではなく、市販のタンパク質を用いて固定化を行い、酵素内包多孔質マイクロカプセル法が酵素タンパク質の固定化に応用できるかどうかを検証した。その結果、最初はタンパク質をカプセル内に保持することはできたが、時間とともにたんぱく質が固定化担体から漏れ出すことが分かった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
平成29年度では、組み換え体大腸菌が産生したarsMを抗FLAGアフィニティーゲルを用いて精製した。その結果、精製条件の最適化を行うことができ、精製した酵素たんぱく質溶液を調製することができた。さらに、調製した試料について、メチルトランスフェラーゼ活性測定キットを使用して、メチル化活性を測定することができた。測定キットを使用することで、酵素活性の簡便な測定が可能となり、実験時間の短縮につながった。しかし、平成29年度実施予定であった無機ヒ素をトリメチルアルシンオキシド（TMAO）に変換する最適な反応条件を検討することが出来ていない。
また、市販のタンパク質を用いて固定化を行い、酵素内包多孔質マイクロカプセル法が酵素タンパク質の固定化に応用できるかどうかを検証した。しかし、時間とともにたんぱく質が固定化担体から漏れ出すことが分かり、その改善が行えていない。
平成28年度に新たに宮崎県内の土壌から分離したKC42株のarsMについて、K63株と同様にarsM遺伝子を持つ組み換えプラスミドを作製することが出来た。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成30年度は、まず調製されたarsMを使って、無機ヒ素をTMAOに変換する最適な条件を検討する。市販のタンパク質を用いて酵素内包多孔質マイクロカプセル法の改善を図り、固定化担体からたんぱく質が漏れ出さないようなカプセルの調製方法を見出す。次に調製されたarsMを酵素内包多孔質マイクロカプセル法で固定化し、実際にメチル化反応を行い、それぞれの操作性および変換効率、反応速度の観点から検討する。
KC42株のarsMについて、K63株と同様に組み換え体大腸菌が産生したarsMを抗FLAGアフィニティーゲルを用いて精製し、調製されたarsMを使って、無機ヒ素をTMAOに変換する最適な条件を検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
（理由) 現在、ヒ素を形態別に測定するための測定機器がまだ修理できていないため。
実験の進捗状況が遅れているため。
（使用計画）測定機器の修理代と平成29年度に実施できなかった実験の消耗品代として、次年度使用額分を使用する。翌年度分は平成30年度の実験計画に基づいて使用する。
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