| 研究課題/領域番号 |
16K00589
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| 研究機関 | 宮崎大学 |
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研究代表者 |
宮武 宗利 宮崎大学, 工学部, 助教 (40315354)
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| 研究分担者 |
塩盛 弘一郎 宮崎大学, 工学部, 教授 (80235506)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 環境技術 / ヒ素の無毒化 / 酵素工学 |
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| 研究実績の概要 |
直接in vitroでヒ素メチル基転移酵素（arsM）を使ってメチル化反応を効率的に行うには、まずメチル化活性の高いarsMの溶液を調製する必要がある。現在、申請者はヒ素メチル化細菌Cellulomonas sp. K63株が保有するarsM遺伝子の塩基配列を明らかにしている。平成28年度までにarsM遺伝子を持つ組み換えプラスミドを作製し、FLAGタンパク質発現システムを使用して、宿主大腸菌DH5αでarsM遺伝子の発現を試みた。電気泳動（PAGE）により、酵素タンパク質の産生を確認した。平成29年度では、組み換え体大腸菌が産生したarsMを抗FLAGアフィニティーゲルを用いて精製し、精製した酵素の活性については、メチルトランスフェラーゼ活性測定キットで測定したが、酵素溶液に含まれる塩が反応を阻害していることが分かった。平成30年度では、酵素溶液に含まれる塩を取り除くために、限外ろ過膜を使った脱塩を行った。その際、濃縮も同時に行うことができた。これにより、固定化に用いる酵素溶液を調製することができた。
本研究では、実用化への可能性を探るため、調製されたarsMを固定化担体に固定化し連続したメチル化反応の可能性を検証することにしている。平成30年度では、マイクロカプセルの調製方法を検討した結果、固定化担体からたんぱく質が漏れ出さないようなカプセルを調製することができた。しかし、長期間保存すると著しい酵素活性の低下がみられた。
平成28年度に新たに宮崎県内の土壌から分離したヒ素メチル化細菌Bordetella petrii KC42株のarsMについて、K63株と同様にarsM遺伝子を持つ組み換えプラスミドを作製した。平成30年度では、K63株と同様に組み換え体大腸菌が産生したKC42株のarsMを抗FLAGアフィニティーゲルを用いて精製し、酵素溶液を調製することが出来た。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
平成30年度では、組み換え体大腸菌が産生したarsMを抗FLAGアフィニティーゲルを用いて精製し、塩を含まない酵素たんぱく質溶液を調製することができた。さらに、調製した試料について、メチルトランスフェラーゼ活性測定キットを使用して、メチル化活性を確認することができた。しかし、測定機器の修理に時間を要したため、平成30年度実施予定であった無機ヒ素をトリメチルアルシンオキシド（TMAO）に変換する最適な反応条件を検討することが出来ていない。
また、市販のタンパク質を用いて固定化を行い、酵素内包多孔質マイクロカプセル法が酵素タンパク質の固定化に応用できるかどうかを検証した。しかし、固定化担体からのタンパク質の漏れは改善することが出来たが、長期に保存した場合酵素活性の著しい低下がみられ、その改善が行えていない。
平成28年度に新たに宮崎県内の土壌から分離したKC42株のarsMについて、K63株と同様に組み換え体大腸菌が産生したarsMを抗FLAGアフィニティーゲルを用いて精製し、酵素溶液を調製することが出来た。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成31年度は、測定機器の修理が完了したため、ヒ素を形態別に測定することが出来るようになった。まず調製されたarsMを使って、無機ヒ素をTMAOに変換する最適な条件を検討する。市販のタンパク質を用いて酵素内包多孔質マイクロカプセル法の改善を図り、長期保存でも酵素活性を維持するようなマイクロカプセルの調製方法を見出す。次に調製されたarsMを酵素内包多孔質マイクロカプセル法で固定化し、実際にメチル化反応を行い、それぞれの操作性および変換効率、反応速度の観点から検討する。
KC42株のarsMについて、調製されたarsMを使って、無機ヒ素をTMAOに変換する最適な条件を検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
測定機器の修理に時間を要したため、当初計画から実験の遅延が生じ実施できていない実験がまだある。そのため、期間を延長した。未使用額については、次年度実施できていない実験の消耗品代と機器使用料、廃液処理費、研究成果投稿料に使用する。
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