| 研究課題/領域番号 |
16K00882
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| 研究機関 | 同志社大学 |
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研究代表者 |
野口 範子 同志社大学, 生命医科学部, 教授 (40198578)
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| 研究分担者 |
斎藤 芳郎 同志社大学, 生命医科学部, 准教授 (70357060)
浦野 泰臣 同志社大学, 生命医科学部, 助教 (00546674)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | オキシステロール / ビタミンE / 酸化ストレス / 膜の流動性 / 神経細胞死 / 神経変性疾患 / 脂肪滴 |
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| 研究実績の概要 |
コレステロールの酸化物である24S-ヒドロキシコレステロール(24S-OHC)を神経芽腫細胞（SH-SY5Y細胞）に作用させると、ネクロトーシス様の細胞死が誘導される。ビタミンE８種類の同族体の中でα-Tocは24S-OHC誘導性細胞死を抑制するが、α-Toc3は抑制しないことが示されていた。
１）今年度は、24S-OHC 誘導性の神経細胞死に対するγ-Tocとγ-Toc3の抑制効果を評価した。α-体と同様に、10~50 μMのγ-Tocは濃度依存的に細胞死を抑制するのに対して、5~20 μMのγ-Toc3は細胞死を抑制せず、30 μMのγ-Toc3ではそれ自身による細胞毒性が示され、24S-OHC誘導性の神経細胞死を増悪させた。細胞内に活性酸素種を発生させるクメンヒドロペルオキシドによる細胞死に対しては、４種のビタミンEはいずれも抑制効果を示した。
２）レチノイン酸(RA)で分化させたSH-SY5Y細胞を24S-OHCで刺激して誘導したアポトーシスを、α-Tocは抑制するがα-Toc3は抑制しないことが示された。分化した細胞をクメンヒドロペルオキシドで処理した場合には活性酸素種を検出するDCFHの蛍光が増加するのに対して、24S-OHC処理では蛍光はみられなかった。
以上の結果から、分化、未分化にかかわらず、24S-OHCは細胞の酸化ストレスを亢進することなく細胞死を誘導し、Tocはα-、γ-体共にラジカル捕捉型抗酸化以外の機能によって細胞死を抑制することが示された。そして、Toc3はα-、γ-体共にその機能がないことが明らかとなった。
３）24S-OHC刺激時のSH-SY5Y細胞に形成される脂肪滴様構造など形態変化に対するα-Tocとα-Toc3の影響を見るため、電子顕微鏡標本の作成をおこなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
24S-OHC-脂肪酸エステル産生へのビタミンEの影響を調べるために、HPLCおよびガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)を用いて細胞内の24S-OHCとそのエステル体を定量する方法をすでに確立しているが、さらに正確な測定を可能にするための条件検討については計画通り着手し進行中である。
カスパーゼ８発現条件下での酸化ストレスの評価を行う目的で、RA刺激によりカスパーゼ８を誘導した神経細胞において、２種類の蛍光プローブを用いて24S-OHCによる酸化ストレス亢進の有無を検出することも計画していた。しかし、４種のビタミンEの、クメンヒドロペルオキシドが誘導する細胞死に対する抑制効果と24S-OHC誘導性細胞死に対する抑制効果の結果のちがいから、24S-OHCは細胞に酸化ストレスを亢進することなく細胞死を誘導し、Tocはα-体、γ-体共にラジカル捕捉型抗酸化以外の機能によって細胞死を抑制することが明らかになり、計画変更をするのが適当と考えられた。
その他はすべて計画どおりに進んでいる。
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| 今後の研究の推進方策 |
１）電子顕微鏡標本の観察を行い、細胞の微細構造へのビタミンEの影響を評価する。とくに小胞体膜構造や脂肪滴構造への影響を調べる。
２）24S-OHC-脂肪酸エステル産生へのビタミンEの影響を調べるために、HPLCおよびガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)を用いて細胞内の24S-OHCとそのエステル体を定量する方法について、さらに正確な測定を可能にするための条件検討を進める。
３）24S-OHC誘導性細胞死を抑制するTocと抑制しないToc3の化学構造の違いは、側鎖の二重結合の数の違いで、Tocは０個、Toc3は３個の二重結合をもつ。この違いが細胞の膜の流動性に異なる影響を与え、その結果細胞死抑制効果の違いが生じるという仮説をたてた。これを証明するために、二重結合の数が、１個のmonoenol体、２個のdienol体を用いて、それぞれの24S-OHC誘導性細胞死への抑制効果を調べる。
４）ビタミンE同族体の混合処理による細胞死への効果を検討し、最適濃度を求める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
RA刺激によりカスパーゼ８を誘導した神経細胞において、２種類の蛍光プローブを用いて24S-OHCによる酸化ストレス亢進の有無を検出することも計画していた。しかし、４種のビタミンEのクメンヒドロペルオキシドが誘導する細胞死に対する抑制効果と24S-OHC誘導性細胞死に対する抑制効果の結果から、24S-OHCは細胞に酸化ストレスを亢進することなく細胞死を誘導し、Tocはα-体、γ-体共にラジカル捕捉型抗酸化以外の機能によって細胞死を抑制することが明らかになり、計画変更をするのが適当と考えられた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
Tocはα-体、γ-体共にラジカル捕捉型抗酸化以外の機能によって細胞死を抑制することが明らかになり、抑制するTocと抑制しないToc3の化学構造の違いは、側鎖の二重結合の数の違いで、Tocは０個、Toc3は３個の二重結合をもつ。この違いが細胞の膜の流動性に異なる影響を与え、その結果細胞死抑制効果の違いに関係すると考えられる。これを証明するために、二重結合が、１個のmonoenol体、２個のdienol体を用いて、それぞれの細胞死への抑制効果を調べる。次年度使用額はこの化合物の合成、もしくは天然物からの抽出に用いる。
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