| 研究課題/領域番号 |
16K00902
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| 研究機関 | 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所 |
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研究代表者 |
石見 佳子 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所, 国立健康・栄養研究所 食品保健機能研究部, 部長 (50154159)
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| 研究分担者 |
石見 幸男 茨城大学, 理学部, 教授 (80159772)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 植物性エストロゲン / 大豆イソフラボン / 細胞増殖 / 細胞分化 / 脂肪細胞 / 乳がん細胞 / オートファジー |
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| 研究実績の概要 |
研究目的:近年、エストロゲン誘導体やポリフェノールが種々の細胞のオートファジーに影響することで、脂質代謝の調節やがんの増殖に関与する可能性が報告されている。本研究では、大豆イソフラボンをはじめとする植物性エストロゲンによる、脂肪細胞、骨系細胞及び乳がん細胞の増殖と分化のメカニズムを明らかにする目的で、自食作用（オートファジー）役割を中心に解析する。
研究計画：脂肪細胞の培養系に植物性エストロゲンを添加し、細胞増殖と分化脂肪蓄積抑制作用を評価するとともに、オートファジーに特異的な色素で染色することで関連を検討する。植物性エストロゲンが、乳がん細胞のサイクリンD1、Myc及びMCM2-7タンパク質に対し、量的、質的影響を与えるかどうかをタンパク質のウエスタン解析により調べる。
研究結果:
[有効性評価]マウス脂肪細胞株MC3T3-L1細胞を用い、脂肪細胞の増殖と分化に伴い発現するオートファジー関連遺伝子についてRT-PCRにより解析した。その結果、MC3T3-L1細胞の培養2日目にBeclin-1等のオートファジー関連遺伝子の発現が上昇し、3日目から低下し、7日目まで継続することが判明した。ゲニステインは、Beclin-1の遺伝子発現を抑制した。
[安全性評価]乳がん由来のMCF-7細胞を1μMダイゼイン存在下に一日培養した時に、S期細胞の割合が約２倍に増加した。この時に、MCM7タンパク質の量は1.5倍に増加した。一方で、サイクリンD1の核局在化は変わらなかった。ダイゼイン非存在下で、MCF-7に、オートファジー阻害剤のBafilomycinを添加すると、S期細胞の割合が低下し、一方で、多くの細胞がS期途中で停滞することが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
[有効性評価]脂肪細胞の増殖と分化の初期にオートファジー関連因子の遺伝子発現が上昇することが明らかになった。増殖と分化の初期に認められるオートファジーが、その後の脂肪細胞の分化に重要な役割を果たすことが先行研究で報告されており、大豆イソフラボンの一種であるゲニステインが脂肪細胞の分化の初期のオートファジーを抑制することは新規である。28年度の研究計画を80％達成することができた。
[安全性評価]大豆イソフラボン存在下に培養した乳がん細胞のS期細胞の増加が、MCMタンパク質の量的増加を伴うことを明らかにした。おそらく、そのことが原因で、DNA複製開始と進行が促進されると考えられる。つまりG1期の進行がイソフラボンにより促進されると考えられるが、サイクリンD1の結果から、PI3K-AKT経路の刺激というよりは、それ以外の機構を介して促進すると考えられる。Bafilomycin添加の結果から、通常培養下のMCF-7細胞のS期進行にオートファジーが関与する可能性が示唆されるが、この効果がオートファジー特異的かどうかを今後見極める必要がある。28年度の研究計画を80%達成することができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
[有効性評価]29年度は、骨芽細胞MC3T3-E1の培養系（飢餓培地または通常培地）に、植物性エストロゲン（ダイゼイン、ゲニステイン等）を添加し、細胞増殖への影響をMTT Assayで評価する。また、分化の指標であるアルカリフォスファターゼ活性、オステオカルシン、オステオポンチン、osterix、Runx2、各遺伝子発現への影響を調べるとともに、オートファジー関連因子の遺伝子発現への影響を評価する。関与が認められた場合は、阻害剤及び活性化剤を添加してこれらの指標への影響を評価する。
[安全性評価]イソフラボンを添加した乳がん細胞に、オートファジー阻害剤や活性化剤を共存させ、DNA合成や細胞増加に対する影響を調べる。DNA合成細胞はDNAに取り込まれたブロモデオキシウリジンを蛍光顕微鏡で検出することで検出する。処理細胞における、サイクリンD1、Myc, MCM2-7タンパク質、およびHIF-1Aタンパク質の変動をウエスタン解析や細胞染色により調べる。オートファジー作用剤としては、リソソームを阻害するBafilomycinの他に、3-methyladenine (3-MA)、6-aminonicotinamide (6-AN)を用いる予定である。加えて、オートファジー反応の変化をとらえる実験系を確立する。
HIF-1AはMCM2-7に結合するとともに、MCMローダーのCDC6タンパク質に結合し、最終的にMCM2-7ヘリカーゼの活性化を抑制すると報告されている(Hubbi et al., 2014)。通常酸素条件下などでHIF-1Aはオートファジーにより分解制御を受ける。G1期進行において、HIF-1Aがオートファジーにより分解されることでMCMが活性化される流れが考えられる。そこで、HIF-1AとMCMとの相互作用について解析する。
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