| 研究課題/領域番号 |
16K00960
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| 研究機関 | 京都教育大学 |
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研究代表者 |
梶原 裕二 京都教育大学, 教育学部, 教授 (10281114)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 分裂細胞 / 代替動物実験 / カエル / ブロモデオキシウリジン / 小腸上皮細胞 / ケラチノサイト / 肢芽 |
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| 研究実績の概要 |
従来、動物を用いた実習はマウスが多く用いられた。しかし、「動物愛護管理法の改正」から生命系の大学等を別にして、哺乳類のマウスを用いた実験は簡単に実施できない。しかし、生物教育において実物を用いた実験は必要不可欠で、新課程で内容が増した高等学校や大学初期課程で実施できる「マウスの代替動物実験」の開発を目的とする。
「本研究室で開発した簡易凍結徒手切片法」を用いると、これまで難しかった動物の組織標本を短時間で作成できる。この手法を用いて、従来マウスを用いて行われたブロモデオキシウリジン(BrdU)を用いた分裂細胞の標識実験についてツメガエルを代替動物として確立する。(2)チロキシンで誘発した幼生の変態に伴う細胞死・分裂細胞の変化など、学校現場で簡便に実施できる代替動物の生理実験を開発する。
多細胞動物における細胞の増殖は、成体の発生・維持に重要な役割を持つ。代表的な例として、小腸上皮の置換がある。小腸底のクリプトと呼ばれる穴には小腸上皮細胞の幹細胞が存在する。幹細胞由来の分裂活性の高い細胞が増殖して上皮細胞を産生し、上部へと押し上げる。その結果、ヒトでは7日、マウスでは3日で上皮細胞が置換される。BrdUは、S期のDNAにチミジンの代わりに分裂細胞に取り込まれ標識できる。
この手法を参考に、マウスの代替動物として、ツメガエルの子ガエルと幼生を、マウスに準じたBrdU濃度で48時間標識した。簡易凍結徒手法で標本を作成し、抗BrdU抗体・酵素抗体法で検出した。その結果、子ガエルの、腸上皮に散在、皮膚下部の組織中に多数、また、変態中の幼生の、腸上皮に散在、発達中の肢芽に密に陽性細胞が検出できた。特に、皮膚下はケラチノサイト幹細胞由来の分裂細胞、後肢芽は間充織の分裂細胞と思われる。これらの結果から、カエルを代替動物として、分裂細胞を標識・検出する実験が開発できたと判断できる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
高等学校生物では、細胞分裂を観察する実験は、タマネギ根端の体細胞分裂、ムラサキツユクサやバッタの減数分裂の観察が一般的である。それらは分裂期における染色体に注目したものである。一方、植物や動物を多細胞生物として捉えた場合、細胞分裂・増殖は、成体の発生・維持に重要な機能をもち、体のどの部分に増殖細胞があるかは大切な視点となる。例えば、マウスの小腸上皮細胞は幹細胞から連続して作られ3日で代謝する。また、生物基礎においても、AGTCの塩基を持つヌクレオチドが相補的に重合しDNAが複製されることを学ぶ。しかし、この現象を確かめる実験は一般的でない。
先の小腸上皮の分裂細胞の検出のように、生命科学の材料としてマウスが代表的であるが、動物愛護法により羊膜類以外の動物への代替が推奨される。そこで、マウスの代替として、アフリカツメガエルを用いた代替実験を検討している。
本科研費の最初に当たるH28年度で、(1) ブロモデオキシウリジン(BrdU)を用いることで、子ガエル、変態中の幼生の分裂細胞が検出できた。(2) BrdU濃度、標本作成法、酵素抗体による陽性細胞の検出法が確定できた。(3) 小腸上皮における分裂細胞がカエルとマウスでは異なること、表皮のケラチノサイトには分裂細胞が多数存在すること、変態中のオタマジャクシ後肢芽の間充織には密に分裂細胞が存在すること、などの知見を得た。
これらの結果から、高等学校や大学初期課程で実施可能な、マウスなど哺乳類の代替動物実験としてカエルが有効であることが示せた。また、多細胞動物の体内で細胞分裂の分布を見ることで、それぞれの組織における細胞分裂の生理的な意義を考察する実験、生物基礎の分子生物学の単元で、これまで一般的でなかったヌクレオチドを用いたDNAの複製実験として利用できる可能性が示せた。このような進捗状況から、概ね順調と考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
マウスで一般的なブロモデオキシウリジン(BrdU)による分裂細胞の標識は、これまで使われてきた、放射性3H-チミジン、蛍光標識チミジンと異なり、本研究室が開発した「簡易凍結徒手切片法」と併せ、蛍光顕微鏡など特別な設備がない高等学校でも、通常の顕微鏡さえあれば実施可能な実験である。また、H28年度の本研究結果から、マウスの代替動物としてカエルを用いた実験が確立できた。カエルで分裂細胞が標識・検出できたことから、他の様々な動物（植物でさえも）を材料とした実験へと展開する可能性が出てきた。幅広い生物で応用できるとその意義は大変大きいと思われる。
H29年度以後は、(1) より解剖しやすく、低価格で簡単に入手でき、飼育も容易な魚類、例えば、フナ、メダカ、キンギョなどを材料にして分裂細胞の標識・検出実験を確立する。(2) さらに広い範囲の動物という点で、脊椎動物以外、ミミズなどの環形動物、アサリなどの軟体動物、発生実験で一般的なウニなどの棘皮動物を材料にして、分裂細胞の標識・検出実験を確立する。(3) 植物の芽生えや成長中の幼植物の分裂細胞、発達中の葉原基における分裂細胞、茎頂・根端分裂組織の分裂細胞など植物の実験が可能かどうか検討する。
H30年度以後は、上記(1)-(3)の検討に加え、高等学校における実践を行う。さらに、実験の充実として、ツメガエルを材料に、オタマジャクシのチロキシン・ホルモンによる変態の誘導実験、また、福島県の原発事故を受けて放射線科学リテラシーの充実という観点から、動物の分裂細胞への放射線の影響を調べる実験を検討していく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
実験材料費が若干安価で購入できたため、3622円の残額を生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度分と併せ、実験材料費に当て、より充実した実験を計画する。
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