| 研究課題/領域番号 |
16K01395
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| 研究機関 | 日本工業大学 |
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研究代表者 |
佐野 健一 日本工業大学, 工学部, 教授 (80321769)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | ドラッグデリバリーシステム / タンパク質工学 / 細胞内デリバリー / コイルドコイル |
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| 研究実績の概要 |
研究代表者らが、分子設計・開発した細胞内薬物送達キャリアCCPC 140は、剛直で異方性の高い構造を基本骨格とするカチオン性人工タンパク質であり、既知の細胞透過性ペプチドと比較して、100-1000倍の極めて高い細胞透過能を示す。平成28年度は、このCCPC 140の高い細胞透過能が何に由来するのか、を明らかにすることを目指した。CCPC 140の細胞への取込みは、主に広義のエンドサイトーシス経路で進むことはこれまでの研究からも分っていたが、新たに主にマクロピノサイトーシス経路で取込まれることが明らかになった。しかしながら、CCPC 140にGFPを融合したタンパク質の細胞内導入実験の結果からは、驚くべきことが明らかになった。本研究で用いたGFPは、pH感受性が極めて高い。そのため、エンドサイトーシス経路で細胞内に導入された際には、エンドソーム内のpH低下に伴い、その蛍光が見られなくなることが予想される。それに対して、CCPC 140-GFPの細胞内取込み実験の結果から、24時間に渡るGFP由来の蛍光が観察された。これは、エンドサイトーシス経路ではなく、ナノペネトレーションなど他の機構により細胞内に取込まれていることを示唆する。またエンドサイトーシスの阻害剤を用いた実験からは、細胞内への取込み阻害は見られるものの、GFPを融合していないCCPC 140と比べ非エンドサイトーシス経路による細胞内導入がより高い頻度でおこることが分かった。さらに、細胞膜へのGFP由来の蛍光の蓄積が、GFPを融合していないCCPC 140と比べて長時間観察されていることからも、レセプター依存的なエンドサイトーシスの活性化が抑制されていることが分かった。これらの結果は、本研究の目的であるタンパク質薬の細胞内送達システムの確立において極めて重要な知見を与える。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初計画していたエンドサイトーシスの各種阻害剤を用いた実験は、概ね順調に進んでいる。一部、申請時に予想していた結果と大きく異なる結果が得られたものの、CCPC 140のタンパク質薬の細胞内薬物送達キャリアとしての新たな有効性を示すものであったため特に大きな問題とはならない。さらに分子の構造異方性の細胞内デリバリーへの影響についても、定性的な評価実験の結果が出ているなど、概ね順調に進んでいる。
研究成果の一部は、日本生化学会、高分子討論会、ASIA Nano 2016、バイオナノシステムズ研究会での発表の他、日本化学会 Chemistry Letters誌への掲載が決まっている。
これらのことから本研究課題は、おおむね順調に進展しているとした。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成28年度の成果を元に、引続きエンドサイトーシスを活性化するレセプター分子の探索とその評価を続けながら、人工タンパク質の再設計とし細胞内薬物送達キャリアとしての最適化を進める。
平成28年度の成果から、CCPC 140-GFPが高効率で細胞内に取込まれるもののCCPC 140とは明らかに異なるパスウェイが機能している。この両者の比較検討を中心に、CCPC 140の細胞内取込みに置けるエンドサイトーシスを活性化するレセプター分子を探索する。また平成28年度、CCPCの細胞内取込みに置いて、高効率細胞内導入に必要な分子のアスペクト比が、顕微鏡観察などの定性的な評価から明らかになってきた。平成29年度は、FACSを用いた定量的な評価をおこなうとともに、アスペクト比の影響について細胞生物学的な検討を加える。必要に応じて物理化学モデルを構築しシミュレーションを行うことも考えている。
これらの研究成果は、conBio2017（日本分子生物学会、日本生化学会合同年会）、高分子討論会で発表することを予定している他、専門誌への論文投稿をおこなう。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究を進めていく上で必要に応じて研究費を執行した。
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| 次年度使用額の使用計画 |
研究計画に大きな変更は無く、前年度の研究費も含め、当初の予定に従って計画を進めていく。
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