| 研究課題/領域番号 |
16K01399
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| 研究機関 | 明治大学 |
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研究代表者 |
加藤 徳剛 明治大学, 理工学部, 専任教授 (90329110)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 細胞膜 / 生体材料 / 多光子励起顕微鏡 / 微粒子 / 薬物送達システム |
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| 研究実績の概要 |
毒物であるポリカチオンへの暴露に対する、細胞膜の分子配向の乱れを、多光子励起顕微鏡により評価し、細胞毒性やストレスの程度を、従来の細胞試験により評価し、両者の相関を得た。ポリカチオンを含有する培地へ細胞を一定時間曝した後、極性両親媒性色素（RH237）で細胞膜を染色した。そして、RH237由来の光第2高調波発生（SHG）の強度と2光子励起蛍光高度（TPF）の強度を多光子励起顕微鏡で観測した。SHG強度は、細胞膜脂質分子の秩序性を、TPF強度は染色色素量を反映しているとし、各条件でSHG強度をTPF強度で規格化した値を用いて、膜分子配向の非線形光学アッセイとした。このアッセイは、従来の細胞試験と良い相関を示した。従って、細胞膜の分子配向の乱れが、細胞毒性やストレスの原因であることを明らかにしたとともに、本研究で提案した非線形光学アッセイが新たな細胞毒性試験法となることが示せた。
粒径１ミクロンの粒子を、ポリカチオンで被覆したものと、ポリエチレングリコール（PEG）で修飾したものを用意しいて、それらのHeLa細胞への内在化の違いを評価した。いずれの粒子の場合でも、粒子を培地に添加したことにより、マクロピノサイトーシス（MPC）の発生率は1/4から1/5に減少し、粒子による違いが見られなかった。粒子を内在化した細胞の割合は、ポリカチオン被覆粒子の場合、PEG被覆粒子と比べて約1.5倍多かった。それぞれの粒子が内在化される経路の内訳は、ポリカチオン被覆粒子の場合、MPCによる内在化が20%、膜を突き破る内在化が60%で、残り20%が未同定な経路である。PEG被覆粒子の場合、MPCによる内在化が80%で、残り20%が未同定な経路であり、膜を突き破る内在化はほとんど起きていなかった。このように、微粒子表面の状態で内在化した粒子数や内在化の経路の内訳が大きく異なることを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
多光子励起顕微鏡による非線形光学アッセイの確立は、再現性にやや課題が残るものの、当初の予定通り達成された。
また、ポリカチオン被覆粒子とPEG修飾粒子の内在化率と内在化経路の違いや、細胞毒性の違いが評価できたので、「粒子による細胞膜の損傷と、粒子の細胞内移行との関係」の一端が明らかになり、研究目的達成に向けて、着実に進んでいると判断した。
当初、確立した非線形光学アッセイにより、粒子が細胞膜への与える影響をその場観察する計画であった。しかし、ポリカチオン被覆粒子に細胞膜成分が吸着して、粒子もRH237で染色されSHG活性になってしまい、多光子励起顕微鏡によるその場観察ができなかった。しかし、ポリカチオン被覆粒子に細胞膜の一部が静電吸着して、粒子が細胞から膜を剥ぎ取るという新たな知見が示唆された。また、ポリカチオン被覆粒子は、細胞毒性が高いことが従来の細胞毒性試験により明らかになり、ポリカチオン被覆粒子は膜の損傷を引き起こしている。今後、粒子が膜を剥ぎ取りながら細胞内移行する機構を解明することで、研究目的の１つである「粒子が細胞膜に与える影響」について明らかにできるものと判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
粒径１ミクロンの粒子のHeLa細胞への内在化については、内在化経路の内訳の20%が未同定である。種々のエンドサイトーシスに対応した阻害剤を用いて、未同定分の経路を明らかにする。また、表面電荷が負の粒子についても同様の評価を行い、カチオン性の粒子、アニオン性の粒子、そして表面電荷がほとんど無いPEG化粒子の３種類の粒子で、内在化の特性を比較する。また、１ミクロンよりも小さな粒子についても、同様の評価して、粒子の細胞内移行の粒径依存性についても評価していく。また、粒子が細胞内に移行する様子や、内在化した粒子や細胞がその後どのようになるのかを、その場観察することも計画している。
表面電荷を有する粒子が、細胞膜を突き破って内在化される機構を解明する。このような内在化経路をとる粒子は、細胞膜と接触すると、静電相互作用により膜が粒子表面に吸着するものと考えているので、その証拠を探る。また、膜を突き破って内在化されるということは、細胞の生命活動とは無関係に内在化されることを示唆するので、生細胞ではなく脂質２重膜の小胞体（ベシクル）を作製して、ベシクルと微粒子の相互作用について研究を行い、ベシクル内に粒子が移行するのかどうかを検証する。
これまでに用いてきた粒子には、細胞表面のレセプターに結合するリガンドが無い。リガンドレスの粒子の細胞内移行に関する評価を行っている。今後は、粒子表面にリガンドをクロスリンクして、能動的かつ選択的に細胞表面に粒子を吸着させることが、粒子の細胞内移行や細胞膜の構造に、どのような影響をもたらすのかを明らかにする。当面は、リガンドの選択とそれを粒子表面にクロスリンクする方法について、調査する。
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