| 研究課題/領域番号 |
16K01399
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| 研究機関 | 明治大学 |
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研究代表者 |
加藤 徳剛 明治大学, 理工学部, 専任教授 (90329110)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 細胞膜 / 生体材料 / 多光子励起顕微鏡 / 微粒子 / 薬物送達システム |
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| 研究実績の概要 |
これまでに、多光子励起顕微鏡で得られるSHG強度をTPF強度で規格化したISHG/ITPF値が、細胞毒性と相関することを示した。しかし、ISHG/ITPF値の再現性が悪かった。そこで、ISHG/ITPF値が細胞の形状および細胞の密度に依存することが、その原因であることを突き止めた。接着細胞は、継代からの時間で細胞の基板への接着度合いが異なる。継代から観測までの時間を揃え、細胞形状を揃えることで、再現性を向上させた。また、毒物濃度が同じでも、細胞数が少ない方が、より細胞膜への損傷をもたらすことが分かった。特に低濃度の時に顕著であった。そのため、細胞密度を揃えることで、再現性を向上させた。
表面電荷が細胞と同様に負を示すLUVおよびGUVと、表面電荷および大きさが異なるシリカ粒子を接触させ、相互作用を観察した。LUVでは、内包色素の漏出を分光学的に評価し、GUVでは蛍光顕微鏡によりその場観察を実施した。LUV・粒子間に引力が働く場合は、斥力の場合と比べて、ベシクルをより破壊しかつ、ベシクルが破壊されなくても内包色素を漏出させる作用が高いことが分かった。顕微鏡観察では、GUVに粒子が吸着することで内包色素の漏出が起きている様子や、粒子を内在化したGUVなどが観測された。
これまでにポリエチレングリコール（PEG）またはポリカチオンで被覆した粒径１μmの粒子の内在化経路を評価した。そこで、粒径150nmのPEG被覆粒子を細胞に与え、粒径１μmの場合と比較した。粒径を小さくしても多くはマクロピノサイトーシスで内在されることが分かった。粒径１μmの場合と異なる点は、マクロピノソームに粒子が内包されている様子が多く観測されたことと、粒子を内在化した細胞の割合が20%ほど多くなったことであった。また、細胞毒性試験により、ポリカチオンで被覆した粒子は高い細胞毒性を示すことが分かった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまでの研究により、多光子励起顕微鏡による非線形光学アッセイと細胞毒性試験との相関を得たとともに、課題であった再現性の向上に必要な条件を割り出した。そのため、目標であった「非線形光学アッセイを新たな細胞毒性試験法として確立」が達成されたと判断する。
また、接触することで粒子がベシクルに与える影響を、実験的に評価することも計画どおり実施した。細胞に静電吸着する粒子は細胞毒性が高いことことと、ベシクルに吸着する粒子がより多くのベシクルを破壊するとともに、ベシクルを破壊せずに内包色素を放出させる作用があることには、相関がある。内在化機構として、静電吸着する粒子は、膜を突き破って細胞内へ移行することがより確実になった。また、GUVの観察から粒子が内在化したものも観察されたことから、粒子が細胞膜を突き破っても細胞の形状を保ち続けることが、物理的にあり得ることを明らかにした。
種類の異なるポリカチオンで被覆した粒子の内在化を比較する計画であったが、静電吸着する粒子は細胞毒性が高すぎるため、DDSに使用できないことが分かった。そこで、ポリカチオンの種類を変えるのではなく、細胞毒性が低いPEG被覆粒子の内在の粒径依存性を評価した。また、粒径が小さいPEG被覆粒子が、マクロピノソームに内包されている様子をその場観察できたので、PEG被覆粒子がマクロピノサイトーシスで内在化される直接的な証拠を得ることができ、本研究の目的である内在化機構の解明につなげられた。
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| 今後の研究の推進方策 |
粒子のHeLa細胞への内在化については、内在化経路の内訳を評価してきた。細胞に静電吸着する粒子の大半は膜を突き破る経路で、PEG被覆粒子の大半はマクロピノサイトーシスで内在かされることを明らかにした。しかし、まだ未解明な内訳がある。考えられる他の経路として、ファゴサイトーシスの可能性が高いと考えた。そこで、サイトカラシンDという阻害剤を用いて、アミロライドで阻害した場合と比較して、ファゴサイトーシスの寄与を明らかにする。また、細胞の動きをその場観察するためのサンプルステージを作製したので、内在化した粒子や細胞がその後どのようになるのかをその場観察を行う。
これまで内在化に用いてきた粒子には、細胞表面に結合するリガンドや抗体が無い。従って、リガンドレス粒子の細胞内移行に関する評価を行っている。今後は、粒子表面にリガンドや抗体を結合させて、静電吸着でない方法で積極的に細胞表面に粒子を吸着させることが、粒子の細胞内移行や細胞膜の構造に、どのような影響をもたらすのかを明らかにする必要がある。そこで、リガンドや抗体の選択と、それらを粒子表面に結合させる表面修飾を実施する。
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