新しい可溶化法を使った組織成分の定量解析に基づく関節軟骨の包括的評価法の確立

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 16K01821
• 研究機関: 島根大学
• 研究代表者: 三浦 美樹子 島根大学, 医学部, 助教 (40447925)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: 関節軟骨 / グルコサミノグリカン / コラーゲン / 発生

研究実績の概要

当研究は、日本人の５人に１人が罹患する変形性膝関節症の根本的治療のため、関節軟骨組織の包括的な評価方法を確立することを目的としている。当研究室で開発されたtermolysinによる可溶化で可能になった軟骨組織完全可溶化法を用い、ラット組織内高分子成分のグルコサミノグリカン（GAG)とコラーゲンを中心に定量的解析を行っている。コラーゲンの定量的解析には、コラーゲンに特有のハイドロキシプロリン（HP)量を測定した。
H28度は、発生・成熟・老化過程におけるこれら高分子成分の経時的変化について解析した。その結果、成熟段階によって、軟骨組織のマトリックスを構成する高分子成分比は一様ではなく、異なることが示唆された。すなわち、GAG/HPの構成比は発生・成熟段階ごとに大きく異なることが示された。GAGとコラーゲンの局在について発生段階ごとのサンプルを採取し、おおよその組織学的な局在の傾向を把握しているが、これらの定量的解析の結果は組織学的な変化と必ずしも一致しているものではなかった。
一方で、関節軟骨は成熟過程でその組織像が大きく変化する（リモデリング）ため、出生後の組織像の変化に伴って細胞密度も成熟段階ごとに大きく異なっていた。組織の乾燥重量当たりのマトリックス構成成分とともにDNA量についても成熟過程における経時的変化について解析し、関節軟骨の包括的評価を行う指標になるかを検討している。
成熟～老化過程におけるこれらの変化についても同様に解析を進めており、GAGとコラーゲンの変化は発生・成熟過程における変化と比較するとゆるやかであった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

H28度の研究実施計画では、様々な発生・成熟・老化段階のサンプルを採取し、組織的なマトリックス成分の局在等を調べ、H29度にGAGとコラーゲン成分の定量的解析を行う予定であった。
組織学的な解析は、GAGとコラーゲンの局在について発生段階ごとのサンプルを採取し、おおよその傾向を把握し、免疫組織化学的な評価の準備を進めている段階である。同時に、GAGとHPの定量法が当研究室にて確立できたため、採取したサンプルを可溶化し、H29年度に予定していたGAGとコラーゲンの定量を先に行った。出生前後の構成成分の変動が予想以上に大きかったため、当初の予定よりも採取する成熟段階を細かく設定することとなったが、目的とする関節軟骨組織の包括的な評価がより詳細にできる可能性が示唆された。また、関節軟骨は成熟過程で組織はリモデリングされるが、組織像により、発生段階により軟骨細胞密度が大きく異なることが分かったため、当初の解析予定にはなかったが、包括的評価の指標になりうると考え、DNA量についても成熟過程における経時的変化について解析している。
H28年度の実施計画であるコラーゲンの架橋解析については最終的にH30年度の実施計画である包括的なコラーゲン架橋解析評価法の開発に向けて現在、LC-MSを使った条件設定などを行っており、準備が進んでいる。

今後の研究の推進方策

本研究の目的は関節軟骨組織の大部分を占めるマトリックス成分について発生・成熟・老化過程と経時的な変化に関する詳細なデータを蓄積することで最終的には関節軟骨の包括的な評価方法を確立しようとしている。H29年度の実施計画予定はH28年度におおよその成果が出ており、H28年度の実施計画の後回しになった組織学的な詳細な解析について進める予定である。また、最終的なコラーゲンの架橋解析評価につながる解析方法としても予定通りに条件設定などの準備を行う予定である。
現在のところ、研究を遂行する上での予定を変更しなければならない点は特になく、順調に進められると考えている。

次年度使用額が生じた理由

H28年度に予定していた研究実施計画を進める中で、H29年度に予定していたGAGとコラーゲンを先に解析を行うほうが、効率的であったためH29年度に購入予定の試薬等を先に購入した。その結果、金額が異なり3046円が残ることとなった。

次年度使用額の使用計画

購入を後回しになってしまったH28年度に購入予定であった試薬等の購入に使用予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Alteration in plasma free amino acid levels and its association with gout (2017)
  • 著者名/発表者名: MH Mahbub, Natsu Yamaguchi, Hidekazu Takahashi, Ryosuke Hase, Hiroki Amano, Mikiko Kobayashi-Miura, Hideyuki Kanda, Yasuyuki Fujita, Hiroshi Yamamoto, Mai Yamamoto, Shinya Kikuchi, Atsuko Ikeda, Naoko Kageyama, Mina Nakamura, Yasutaka Ishimaru, Hiroshi Sunagawa, Tsuyoshi Tanabe
  • 雑誌名: Environmental Health and Preventive Medicine 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • 査読あり
• [雑誌論文] Plasma free amino acid profiles evaluate risk of metabolic syndrome, diabetes, dyslipidemia, and hypertension in a large Asian population (2017)
  • 著者名/発表者名: Natsu Yamaguchi, M. H. Mahbub, Hidekazu Takahashi, Ryosuke Hase, Yasutaka Ishimaru, Hiroshi Sunagawa, Hiroki Amano, Mikiko Kobayashi- Miura, Hideyuki Kanda, Yasuyuki Fujita, Hiroshi Yamamoto, Mai Yamamoto, Shinya Kikuchi, Atsuko Ikeda, Mariko Takasu, Naoko Kageyama, Mina Nakamura, Tsuyoshi Tanabe
  • 雑誌名: Environmental Health and Preventive Medicine 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • 査読あり
• [雑誌論文] Human thioredoxin-1 attenuates the rate of lipopolysaccharide-induced preterm delivery in mice in association with its anti-inflammatory effect. (2016)
  • 著者名/発表者名: Namba F, Kobayashi-Miura M, Goda T, Nakura Y, Nishiumi F, Son A, Kubota A, Yodoi J, Yanagihara I.
  • 雑誌名: Pediatr Res. 巻: 80(3) ページ: 433-439
  • DOI: 10.1038/pr.2016.100.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] The characterization of matrix contents in the articular cartilage of the knee at the perinatal rats (2016)
  • 著者名/発表者名: Mikiko Kobyaashi-Miura, Harumi Osago, Mineyoshi Hiyoshi, Nobumasa Hara, Mikako Tsuchiya
  • 学会等名: 第89回日本生化学会大会
  • 発表場所: 仙台市 仙台国際センター 東北大学川内北キャンパス
  • 年月日: 2016-09-25 – 2016-09-27
• [学会発表] 定量的オミクス解析のための結合組織の完全可溶化の試み (2016)
  • 著者名/発表者名: 長子 晴美、三浦 美樹子、濱崎 由文、原 伸正、日吉 峰麗、土屋 美加子
  • 学会等名: 第89回日本生化学会大会
  • 発表場所: 仙台市 仙台国際センター 東北大学川内北キャンパス
  • 年月日: 2016-09-25 – 2016-09-27