2016 年度実施状況報告書

ミトコンドリア呼吸鎖超複合体中のコエンザイムQ10量は加齢により低下するのか？

研究課題

研究課題/領域番号	16K01842
研究機関	東京工科大学
研究代表者	加柴美里東京工科大学, 教養学環, 准教授 (80338186)
研究分担者	山本順寛東京工科大学, 応用生物学部, 教授 (60134475)
研究期間 (年度)	2016-04-01 – 2019-03-31
キーワード	ミトコンドリア / 呼吸鎖超複合体 / コエンザイムQ10 / 加齢 / ブルーネイティブ電気泳動
研究実績の概要	加齢に伴いミトコンドリア呼吸機能は低下するが，その原因は解明されていない．ミトコンドリア電子伝達系は呼吸鎖超複合体を形成しており，コエンザイムQ10（CoQ10）もこの中に含まれて存在しているらしい． CoQ10の細胞全体中の濃度は加齢に伴い減少するが,呼吸鎖超複合体中のCoQ10量が加齢により変動するかは不明である．本研究は，呼吸鎖超複合体に結合して存在しているCoQ10量の定量手法を確立し，呼吸鎖超複合体中のCoQ10量の加齢による変動を解析する．さらに，呼吸鎖超複合体へのCoQ10輸送機構の解明を試みる．研究初年度は，ミトコンドリア呼吸鎖超複合体に含まれるCoQ量の解析手法の確立を行った．呼吸鎖超複合体をブルーネイティブ電気泳動（BN-PAGE）にて分離し，複合体画分から有機溶媒を用いてCoQを抽出し，抽出されたCoQをHPLC-ECDにて定量した．まずは分画したミトコンドリアをブルーネイティブ電気泳動（BN-PAGE）にて分離する技術を確立した．BN-PAGEはネイティブ電気泳動を改良した電気泳動手法であり,タンパク質複合体を壊すことなく,分子量により分画することができるとされている．主に膜蛋白質複合体の解析に用いられてきており，ミトコンドリア呼吸鎖超複合体に関する既報もBN-PAGEが多用されている．最初に検討すべき点は，用いる界面活性剤の種類である．本点に関しては，ジギトニンを用いると呼吸鎖超複合体が検出されること，またn-Dodecyl-maltosideを用いるとコンプレックスIやIVが分解して電気泳動されることなど，既報どおりの結果が得られることを確認した．切り出したゲルからのCoQ抽出は，有機溶媒を用いておこなった．ゲルの破砕にはBEADS CRUSHERを用いた.サンプルからのCoQの抽出と測定についても検討し，抽出手法を確立した．
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由研究実績の概要に記載のごとく，呼吸鎖超複合体に結合して存在しているコエンザイムQ10の定量手法が確立できたため．
今後の研究の推進方策	研究初年度に確立した呼吸鎖超複合体中のCoQ測定手法を用いて下記①～④の検討を行う． ①加齢における変動の解析：加齢モデル動物のミトコンドリア呼吸鎖超複合体中のCoQ量の解析を行う．加齢モデル動物としては，老齢正常マウス（1年齢，1.5年齢，2年齢）や早老症モデルマウスを使用する．早老症モデルマウスとしてはKlothoマウス（Clea Japanより購入予定）やSAMマウス（SAM研究協議会に譲渡依頼予定）の使用を予定している． ②様々な病態モデル動物のCoQ量解析：本研究の応用として,CoQ投与効果が期待されている疾患モデル動物のCoQ量を解析する． ③サプリメントとして投与したCoQのミトコンドリア呼吸鎖超複合体への取り込みの検討：実験動物にCoQ10をサプリメントとして餌中に投与し，投与したCoQ10がミトコンドリア呼吸鎖超複合体に取り込まれるかを検討する．実験動物として使用予定のマウスは，イソプレノイド側鎖長が9のCoQ9を主に生合成している．一方，ヒトはイソプレノイド側鎖長が10のCoQ10を主に産生している．CoQ9を産生しているマウスにCoQ10含有餌を投与し，ミトコンドリア呼吸鎖超複合体内のCoQ10量を測定することにより，餌から呼吸鎖へのCoQ取り込み量を測定する． ④呼吸鎖超複合体へのCoQ取り込み機構の解明，特にCoQ10結合タンパク質プロサポシンの役割解明：コエンザイムQ10結合蛋白質プロサポシンに注目している．ミトコンドリアを分離精製したところ，プロサポシン高発現株ではミトコンドリアCoQ10量が上昇し，ノックダウン株では低下していた．これら遺伝子改変株のミトコンドリア超複合体に含まれるCoQ10量の解析を行う．次に超複合体とプロサポシンとの結合について検討する．本解析には，ウエスタンブロッティング手法および，免疫沈降手法をもちいる．
次年度使用額が生じた理由	購入予定の抗体が輸入品で納期がH29年度になるため．
次年度使用額の使用計画	購入予定の抗体の購入費用として使用する．