| 研究課題/領域番号 |
16K01912
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| 研究機関 | 富山大学 |
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研究代表者 |
石本 哲也 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 助教 (40397170)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | ルシフェラーゼ / 細胞骨格 / 活性酸素 |
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| 研究実績の概要 |
前年度に引き続き、ChemicalCALIの基礎的研究を行った。ChemicalCALI技術で用いる蛋白質として、緑の励起光に反応して活性酸素を放出する蛍光蛋白質KillerRed、ホタルの発光蛋白質であるルシフェラーゼの融合蛋白質をkillerfireflyと名付けたが、このkillerfireflyに様々な細胞内局在シグナルを融合させた蛋白質をHEK293T細胞に発現させた。この状態でルシフェラーゼの基質であるルシフェリンを培地に投与すると、ルシフェラーゼの光がKillerRedを励起し活性酸素を発生する。昨年度はアクチン重合をこのkillerfirefly 蛋白質が誘導できることを示したが、今年度、細胞膜に局在するシグナルをkillerfireflyに融合させた蛋白質を発現させた状態でルシフェリンを投与すると、killerfireflyの赤色蛍光を有する細胞内の小胞がふえる傾向が見られた。このことは細胞膜での活性酸素の発生が、エンドサイトーシスやオートファジーのような現象を誘導していることを示唆している。
また、初年度に開発したアクチンの重合を誘導できるkillerfireflyに関して、重合されたアクチンフィラメントの性状を調べた。その結果、このアクチンフィラメントはコフィリンと呼ばれるアクチン結合蛋白質と共局在することが分かった。この共局在はアルツハイマー病で見られるアクチンコフィリンロッドという構造で見られる。このことは、killerfireflyをもちいてアルツハイマー病のモデルを構築できる可能性を示している。
一方でkillerfireflyから放出される活性酸素が非常に少量であると考えられるため、どれくらいの量の活性酸素が発生しているか計測することは、初年度に引き続きできなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
前年度にkillerfirefly蛋白質を用いたChemicalCALI技術を用いて、細胞内のアクチン重合を誘導できることを発見していたが、この重合アクチンがどのような性質を有しているか解析が進んでいなかった。今回、その重合アクチンの性状がコフィリンアクチンロッドと呼ばれる構造と似ていることが分かった。この構造はアルツハイマー病などの神経細胞でみられることが知られており、killerfirefly蛋白質を用いたChemicalCALI技術をアルツハイマー病などのモデル動物作製へ応用する筋道が立ってきた。
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| 今後の研究の推進方策 |
アクチン重合を誘導するkillerfirefly蛋白質に関しては、まず培養神経細胞においてアクチンコフィリンロッドに相当する構造を誘導できるか試す。ルシフェリン投与でアクチンの構造が変化するようであれば、その変化がシナプス形成やシナプス伝達効率に変化を与えるか試験する。killerfireflyで神経細胞のアクチン重合と、それに伴う機能変化を誘導できるようであれば、killerfireflyを発言するトランスジェニックマウス作製に取り掛かる。
killerfireflyからどれくらいの量の活性酸素が放出されているか、生化学的手法を用いて直接計測ができていないので、電子スピン共鳴法などの手法を用いて計測を試みる。計測が可能出れば、アクチンの重合度合と活性酸素放出量との間に相関があるか解析する。
また、アクチン以外の蛋白質の機能をkillerfireflyを用いたChemicalCALI技術で操作できるか、引き続き探索していく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
予定していた海外学会発表を行わなかったため、旅費の使用額が少なかった。また、神経細胞培養など動物を使った実験を行わず、予定したほど試薬を購入しなかったため、物品費が少なくなった。
30年度は、神経細胞培養など、動物を使った実験が増えることが予想され、使用額が増える予定である。
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