| 研究課題/領域番号 |
16K01914
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
下山 敦史 大阪大学, 理学研究科, 助教 (90625055)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | リピドA / Campylobacter jejuni / 自然免疫 / 自己免疫疾患 / アジュバント / リポオリゴ糖 / ガングリオシド / 分子相同性 |
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| 研究実績の概要 |
グラム陰性菌の一種であるCampylobacter jejuni（C.jejuni）は急性腸炎を惹き起こすとともに、感染後、一定の確率で自己免疫疾患を発症させることでも知られている。これは、C.jejuniの細胞膜構成成分であるリポオリゴ糖（LOS）がヒト末梢神経内ガングリオシドと同じ糖鎖構造を含むことに起因するとされている。しかしながら、C. jejuniと同様の分子相同性を有するHelicobacter pyloriなどは自己免疫疾患を惹起しないことから、我々はオリゴ糖部分の分子相同性以外にも要因があると考え、LOSの末端に存在し、一般に自然免疫活性作用を有するリピドAに着目した。C.jejuni由来リピドAは、グルコサミン二糖骨格からなる典型的なリピドAとは異なり、2,3-ジアミノグルコース二糖骨格からなる特異な構造を含むため、未だ合成が達成されておらず、その機能は未解明な部分が多い。本研究では、C.jejuni由来リピドAの効率的合成法を確立し、その機能を解析することで、自己免疫疾患発症への関与について解析を試みるとともに、免疫アジュバントとしての利用を模索する。
平成28年度までに、C.jejuni由来リピドAに特異な2,3-ジアミノグルコース二糖骨格の構築法を確立した。平成29年度は、構築した2,3-ジアミノグルコース二糖骨格に対し、脂肪鎖とリン酸基の導入、脱保護を行うことで、世界初のC.jejuni由来リピドAの合成を達成した。現在、合成したC. jejuni由来リピドAの自然免疫活性化能の評価を進めている。また、C.jejuni由来リピドAは、基本となる二糖骨格を構成する単糖に多様性を有するため（グルコサミンもしくは2,3-ジアミノグルコース）、今後は、これらのライブラリー合成に着手する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究で合成ターゲットとしているC. jejuni由来リピドAは、効率的合成手法が確立されている大腸菌由来リピドA（グルコサミン二糖骨格と6本のアシル鎖、2つのリン酸基からなる）などとは異なり、基本となる二糖骨格を構成する単糖にも多様性がある（グルコサミンもしくは2,3-ジアミノグルコース）。申請者がこれまでに確立してきたリピドA合成戦略は、様々な脂質およびリン酸基パターンのリピドAを合成可能であるが、糖骨格が異なるものには適用できない。また、2,3-ジアミノグルコース二糖骨格の合成例自体がほとんどなく、二糖骨格ライブラリー合成の一貫として一例、報告があるのみで、適切に保護された二糖骨格の合成例は皆無である。このような状態ゆえに、C. jejuni由来リピドAの合成は未だ達成されてこなかった。
平成28年度までに、適切に保護された2,3-ジアミノグルコース二糖骨格の構築を完了していたので、本年度は、ヘキサアシル型C. jejuni由来リピドAの合成を行った。まずは、2,3-ジアミノグルコース二糖骨格への脂肪酸の導入を試みた。合成例のあるグルコサミン二糖体とは異なり、2,3-ジアミノグルコース二糖体のいくつかは、様々な溶媒への溶解性が非常に低く、取り扱いが困難であった。そこで、脂肪酸の導入手順を当初計画（2’, 3’位アミノ基へ脂肪酸を同時に導入した後、2, 3位アミノ基へ脂肪酸を同時に導入する）から変更し、2’, 3’位アミノ基へ脂肪酸を同時に導入した後、3位、2位の順番で逐次導入することで、脂肪酸の導入を完了した。続いて、１, 4’位に対して同時にリン酸化を行った後、脱保護することで、世界初のC.jejuni由来リピドAの合成を達成しており、おおむね計画通りの進捗状況となっている。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでに、2,3-ジアミノグルコース二糖骨格からなるC.jejuni由来リピドAの合成を達成したが、C.jejuni由来リピドAは、基本となる二糖骨格を構成する単糖に多様性を有する（グルコサミンもしくは2,3-ジアミノグルコース）。今後は、これらのライブラリー合成と機能評価に着手する。これまでに合成法を確立したグルコサミン単糖ユニットと2,3-ジアミノグルコース単糖ユニットを組み合わせることですべての糖骨格パターンに対応可能であり、本合成戦略によりC. jejuni由来リピドAの系統的合成を目指す。続いて、合成したC. jejuni由来リピドA群の自然免疫活性化能を評価する。具体的には、合成リピドA群をそれぞれ単球細胞に加え培養した後、培養上清中に放出されるサイトカインの量をELISAにより定量し、糖骨格構造の違いが自然免疫活性化能にどのような影響を与えるか精査する。次に、リピドAのような自然免疫リガンドの存在が獲得免疫活性化に与える影響について調べる。具体的には、市販品のガングリオシドより調整したGM1やGD1aといった糖鎖抗原を単独でマウスに注射した場合と、リピドAを共存させた場合の抗体産生量の違いを評価する。自然免疫リガンドが獲得免疫活性化にどのように関与するのか精査し、C.jejuniの感染後に起こる自己免疫疾患の発症にC.jejuniLOSの糖鎖抗原部分に加え、リピドA部分がどのような影響を与えているのか評価する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成29年度に計上した予算のうち、25万円ほどを未使用分として平成30年度へ繰り越させていただく。これは、主にその他として計上していた機器修理費用、分析依頼費用が予定より抑えられたためである。繰り越し分は、平成30年度の生物活性試験キットの購入費用へと当てさせていただく。
平成30年度の予算全体の使用計画としては、有機合成で日常的に使用し、C. jejuni由来リピドAの合成を達成する上で必要不可欠である有機溶媒と反応試薬類などを有機合成試薬として計上した。使い捨てのパスツールピペット、バイアル管や比較的良く破損するカラム管、NMR管などのガラス器具類も本研究の目的達成に必要であり、ガラス器具としてまとめて計上した。また、合成化合物の精製に日常的に使うシリカゲル充填剤、純水カートリッジなども本研究で必要になるため精製分離消耗品として計上した。同様な理由で、NMR重溶媒やスペクトル用の溶媒類は機器分析消耗品として計上した。
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