人工デザイン膜タンパク質を用いた受容体の細胞外領域認識抗体作製法の開発

2018 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 16K01915
• 研究機関: 愛媛大学
• 研究代表者: 竹田 浩之 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 准教授 (40609393)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: GPCR / 抗体 / HRH1 / 膜貫通ドメイン / 人工デザイン抗原

研究実績の概要

前年度に作製した、ループ部分と膜貫通ヘリックスの間にスペーサーを挿入することで膜貫通ヘリックスを人工的に延長し、ループ部分が膜から露出しやすくした改変ヒスタミン受容体H1 (HRH1)をマウスに免疫し、細胞外領域抗体の誘導を評価した。免疫した人工デザイン抗原は、３アミノ酸残基のフレキシブルリンカーを膜貫通ドメインと細胞外ループの間にそれぞれ挿入したSpacer inserted HRH1と、膜貫通ドメインの細胞外側の末端3アミノ酸を反復することで膜貫通領域を伸張したElongated TM HRHの２種である。
改変HRH1 ２種をコムギ無細胞膜タンパク合成系を用いて調製し、それぞれ1mgの免疫抗原を得た。各抗原をそれぞれ３頭のマウスに2週おき計４回の免疫と採血を行い、マウス抗血清に含まれるポリクローナル抗体を解析した。Western blotとBiLIA法（ビオチン化プロテオリポソームとAlphaScreenを用いた相互作用解析）では、Spacer inserted HRH1抗血清、Elongated TM HRH抗血清のいずれもが野生型ヒトHRH1に反応した。次いでHRH1を一過性発現させたHek293A細胞を用いたFACS解析を実施したところ、Spacer inserted HRH1抗血清、Elongated TM HRH抗血清のいずれもが細胞外領域に結合した。このことは、膜貫通領域を延長した人工膜タンパク質を免疫することで、狙い通りに細胞外領域に結合する抗体を誘導できたことを示している。
最後に、血清から精製したポリクローナル抗体がHRH1の阻害活性を有するかどうかをラジオリガンドアッセイを用いて評価した。抗血清をProtein Gセファロースとゲル濾過にかけてポリクローナル抗体精製した。HRH1とトリチウムラベルしたH1リガンドの結合反応に精製したポリクローナル抗体を添加し、ラジオリガンド結合量を測定したが、抗体添加による阻害活性を確認することはできなかった。

研究成果

• [雑誌論文] Engineered membrane protein antigens successfully induce antibodies against extracellular regions of claudin-5 (2018)
  • 著者名/発表者名: Hashimoto Yosuke、Zhou Wei、Hamauchi Kohtaroh、Shirakura Keisuke、Doi Takefumi、Yagi Kiyohito、Sawasaki Tatsuya、Okada Yoshiaki、Kondoh Masuo、Takeda Hiroyuki
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 8 ページ: 8383
  • DOI: 10.1038/s41598-018-26560-9
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Functional G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) Synthesis: The Pharmacological Analysis of Human Histamine H1 Receptor (HRH1) Synthesized by a Wheat Germ Cell-Free Protein Synthesis System Combined with Asolectin Glycerosomes (2018)
  • 著者名/発表者名: Suzuki Yasuyuki、Ogasawara Tomio、Tanaka Yuki、Takeda Hiroyuki、Sawasaki Tatsuya、Mogi Masaki、Liu Shuang、Maeyama Kazutaka
  • 雑誌名: Frontiers in Pharmacology 巻: 9 ページ: 38
  • DOI: 10.3389/fphar.2018.00038
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Production of Immunizing Antigen Proteoliposome Using Cell-Free Protein Synthesis System (2018)
  • 著者名/発表者名: Zhou Wei、Takeda Hiroyuki
  • 雑誌名: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology 巻: 1868 ページ: 49～67
  • DOI: 10.1007/978-1-4939-8802-0_7
• [学会発表] GPCRの細胞外領域認識抗体の効率的作製を目指した人工抗原デザイン (2018)
  • 著者名/発表者名: 浜内 孝太郎、澤崎 達也、竹田 浩之
  • 学会等名: 第41回分子生物学会年会
• [学会発表] 人工デザイン膜タンパク質抗原を用いたClaudin-5細胞領域結合抗体の開発 (2018)
  • 著者名/発表者名: 橋本洋祐、Wei Zhou、浜内孝太郎、白倉圭佑、土居健史、八木清仁、澤崎達也、岡田欣晃、近藤昌夫、竹田浩之
  • 学会等名: 第41回分子生物学会年会
• [学会発表] 人工デザイン膜タンパク質抗原を用いたClaudin-5細胞外領域結合抗体の開発 (2018)
  • 著者名/発表者名: 橋本 洋佑、Zhou Wei、浜内 孝太郎、白倉 圭佑、土井 健史、八木 清仁、澤崎 達也、岡田 欣晃、近藤 昌夫、竹田 浩之
  • 学会等名: 第13回無細胞生命科学研究会
• [学会発表] Cell-free Synthesized Proteoliposome; a New Tool for Antibody Development against Integral Membrane Proteins. (2018)
  • 著者名/発表者名: Hiroyuki Takeda
  • 学会等名: World Gene Congress 2018
  • 国際学会
• [学会発表] Accelerate drug discovery by cell-free technology (2018)
  • 著者名/発表者名: Hiroyuki Takeda
  • 学会等名: Protein Island Matsuyama (PIM) 2018 International Symposium
• [備考] 愛媛大学プロテオサイエンスセンター プロテオ創薬科学部門 Publications
  • URL: http://www.pros.ehime-u.ac.jp/proteodrugdiscovery/data/pg23.html
• [備考] 愛媛大学プロテオサイエンスセンター 研究業績
  • URL: http://www.pros.ehime-u.ac.jp/result/index.php