| 研究課題/領域番号 |
16K01922
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| 研究機関 | 早稲田大学 |
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研究代表者 |
北口 哲也 早稲田大学, 総合研究機構, 主任研究員(研究院准教授) (60432374)
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| 研究分担者 |
坪井 貴司 東京大学, 大学院総合文化研究科, 准教授 (80415231)
上田 宏 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 教授 (60232758)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | GFP |
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| 研究実績の概要 |
本年度は複数のマルチカラーバイオセンサーを開発するために、まずは緑色のcGMPセンサーに取り組んだ。緑色蛍光タンパク質のバリアントのシトリンにマウスのフォスフォジエステラーゼ5（PDE5）のcGMP結合領域を挿入し、センサーを開発することを試みた。挿入する領域は蛍光タンパク質の発色団近傍の領域である。これはcGMPに結合したときのPDE5の構造変化が発色団近傍の電子状態を変化させ、輝度変化を引き起こすことを想定している。最初に作製した結合領域を挿入しただけのプロトタイプcGMPセンサーはcGMP添加による輝度変化をほとんど起こさなかった。そこで、挿入する領域のアミノ末端とカルボキシル末端にそれぞれにリンカーを導入し、アミノ酸付加および欠失させたところ、アミノ末端に２アミノ酸、カルボキシル末端に０アミノ酸を付加した変異体が一番大きな輝度変化を引き起こした。このリンカー長調整による輝度変化は２０％程度であった。つぎに挿入したリンカー領域の近傍のアミノ酸をランダム変異により置換したところ、最終的には６５０％（７．５倍）の蛍光輝度が変化する緑cGMPセンサーを獲得することができた。このcGMPセンサーを大腸菌で発現させリコンビナントタンパク質の励起蛍光スペクトルを測定したところ、498nmと522nmにピークがあり、予想通り緑色の蛍光を発するセンサーであった。次に培養細胞に導入し、NOのドナーであるSNAPや膜透過性のcGMPである8ブロモcAMPで刺激したところ、細胞内のcGMPの上昇を検出できた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
一年目にして蛍光センサーの開発に成功している。
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| 今後の研究の推進方策 |
前倒しでマルチカラー化を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
思いのほかプローブの作製がうまくいき、消耗品などを節約することができたため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
複数のプローブ開発と、マルチカラー化を早期に始める。
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