| 研究課題/領域番号 |
16K01922
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| 研究機関 | 東京工業大学 |
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研究代表者 |
北口 哲也 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 准教授 (60432374)
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| 研究分担者 |
坪井 貴司 東京大学, 大学院総合文化研究科, 教授 (80415231)
上田 宏 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 教授 (60232758)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 蛍光タンパク質 / バイオセンサー / バイオイメージング |
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| 研究実績の概要 |
本年度は、cAMPセンサーの赤色化に取り組んだ。マウスEpac1のcAMP結合領域を赤色蛍光タンパク質mAppleの発色団近傍に挿入することで、cAMPの濃度変化に応答して、蛍光輝度の変化するセンサーの構築を目指した。昨年度に緑色cGMPセンサーを構築した方法と同様の方法を用い、蛍光タンパク質とcAMP結合領域の間のリンカーの長さとアミノ酸配列を最適化することで、４倍の輝度変化を起こす赤色cAMPセンサーの構築に成功した。また、このセンサーはcGMPにはあまり反応しないことから、cAMPを選択的に検出できるセンサーであった。さらにこの赤色cAMPセンサーを分光光度計で吸収を測定したところ、420nmと570nmにピークがあった。cAMPの添加により、420nmのピークが減少し、570nmのピークが増加していることから、蛍光輝度変化が、発色団のプロトン化／脱プロトン化によって引き起こされていることが示唆された。
次に、この赤色cAMPセンサーを培養細胞に導入し、蛍光顕微鏡で検討したところ、アデニル酸シクラーゼの活性化やフォスフォジエステラーゼの阻害により蛍光輝度が上昇し、またアデニル酸シクラーゼの阻害により蛍光輝度が低下することから、生細胞イメージングが可能であることがわかった。また光駆動型アデニル酸シクラーゼを導入し、青色光（赤色センサーを励起しない）で活性化したところ、cAMPの産生を検出することができた。さらにマウス個体のアストロサイトに導入し、二光子励起顕微鏡で観察したところ、アデニル酸シクラーゼとフォスフォジエステラーゼの阻害によるcAMP産生をin vivoで可視化できた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
緑色と赤色のセンサー開発に成功しており、マルチカラー化は近い。
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| 今後の研究の推進方策 |
３色目のセンサー開発を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
センサー開発が順調に進み、消耗品を節約できたため。
マルチカラー化のみならず、異なる分子認識ドメインを用いたセンサーの開発も挑戦する。
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