非天然官能基ポスト標識技術による微小マイクロ結晶構造解析法の開発と応用

2021 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 16K01942
• 研究機関: 国立研究開発法人理化学研究所
• 研究代表者: 別所 義隆 国立研究開発法人理化学研究所, 放射光科学研究センター, 客員研究員 (70242815)
• 研究期間 (年度): 2016-10-21 – 2022-03-31
• キーワード: 生物・生体工学 / バイオテクノロジー / 結晶構造 / タンパク質 / メチル基転移酵素 / tRNA / 人工補酵素 / S-アデノシルメチオニン

研究実績の概要

AdoMetを補酵素とするDNAメチル基転移酵素の一部には、AdoMetの代わりに人工官能基を持つAdoMet類似体を使用することで、天然のメチル基以外にエチル基やプロピル基などの非天然官能基も転移する能力がある。我々は、RNAメチル基転移酵素を用いて、この転移が低分子官能基だけでなく、通常は立体障害のため反応が困難なGABAなど比較的に分子量の大きな官能基にも適用できることを発見した。この技術を応用すれば、生体高分子の特定の位置にプローブを導入することが可能になる。昨年度までに、超好熱性真正細菌Aquifex aeolicusのメチル基転移酵素TrmIを使用し、tRNA分子のT-Loop部位にCy3、Cy5やローダミンなどの蛍光色素を導入する技術を開発した。この蛍光色素を導入したtRNAと、tRNA結合タンパク質の複合体の結晶化に成功した。SPring-8のマイクロフォーカスビームライン・BL32XUに蛍光・レーザー装置を設置し、Ｘ線測定に使用するゴニオステージ上で、この結晶から実際に蛍光の検出に成功した。今年度、非天然官能基の導入により作られた蛍光tRNA・タンパク質複合体の結晶化条件をさらに最適化し、BL32XUの特性を生かす蛍光マイクロ結晶を作製した。このtRNA・タンパク質複合体の蛍光マイクロ結晶から、構造解析用のＸ線回折データセットの取得し、位相回復に成功した。また、リトアニアの海外共同研究者が開発したDNAメチル基転移酵素の非天然官能基プロービング法を応用し、BL32XUでDNA修復酵素のマイクロ結晶の最適化にも成功した。SACLAのXFELにも使用できるマイクロ結晶から、高分解能のＸ線回折データが得られる実験条件を見出した。

研究成果

• [国際共同研究] Vilnius University(リトアニア)
  • 国名: リトアニア
  • 外国機関名: Vilnius University
• [雑誌論文] Serial crystallography captures dynamic control of sequential electron and proton transfer events in a flavoenzyme (2022)
  • 著者名/発表者名: Maestre-Reyna M, Yang CH, Nango E, Huang WC, Putu EPGN, Wu WJ, Wang PH, Franz-Badur S, Saft M, Emmerich HJ, WHY, LCC, HKF, CYK, LJH, WJH, GW, CCW, PAH, SM, OS, HY, JY, YA, TR, TT, LF, TK, HKC, KS, Schapiro I, Spadaccini R, Royant A, Yamamoto J, Iwata S, Essen LO*, Bessho Y*, Tsai MD*
  • 雑誌名: Nature Chemistry 巻: － ページ: －
  • DOI: 10.1038/s41557-022-00922-3
  • 査読あり / 国際共著