| 研究課題/領域番号 |
16K01949
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| 研究機関 | 東京薬科大学 |
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研究代表者 |
石橋 智子 東京薬科大学, 薬学部, 助教 (50453808)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | パラノーダルジャンクション / ミエリン / プルキンエ細胞 / IP3R1 / カルシウム / 軸索腫脹 |
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| 研究実績の概要 |
有髄神経軸索ランビエ絞輪部両隣、パラノード部分に存在する髄鞘-軸索間結合paranodal axoglial junction (AGJ)の軸索機能恒常性維持への関与、特にカルシウム調節に関与している分子IP3R1、および小胞体（ER）の軸索内局在をAGJがどのように制御しているのか明らかにすることを目的に研究を行っている。H29年度はAGJ形成不全マウスCST欠損マウス(CSTko)を用い以下の結果を明らかにした。
CSTkoプルキンエ細胞軸索には特徴的な腫脹が認められ、腫脹形成の初期段階にIP3R1が軸索局所に集積し、ERストレスやオートファジーの所見もあり、12ヶ月齢以降ではプルキンエ細胞死も認められた。CST+/-マウスとIP3R1+/-マウスの交配より得たCST-/-/IP3R1+/-マウスの解析の結果、プルキンエ細胞軸索の腫脹数がCST-/-/IP3R1+/+マウスと比較して有意に減少し、細胞死もほとんど認められず、CSTkoマウスで認められる神経症状も改善していた。すなわちIP3R1がCSTkoマウスのプルキンエ細胞軸索腫脹の引き金であることが明らかになり、IP3R1を介したIP3 シグナリングが軸索恒常性維持に必須であることが示唆された。
IP3R1はミトコンドリアと近接する小胞体領域mitochondria-associated ER membrane (MAMs)に豊富に存在している。CSTko マウスIP3R1陽性プルキンエ細胞軸索腫脹には、MAMsに豊富に存在するVDACをはじめ、Grp75、ERLIN2、Sigma1RおよびMitofusin2の集積も認められた。これら分子は、IP3R1陽性腫脹部分のみに集積し、正常軸索径の部位には認められない。したがってAGJ形成が有髄軸索のIP3R1の局在のみならずMAMsの局在に関与していることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
CSTko小脳プルキンエ細胞軸索腫脹部分の組織学的解析はほぼ終了し、また電子顕微鏡による微細構造の解析も順調である。一方、腫脹部以外の正常部位の解析は進んでいない。軸索腫脹部とそれ以外の正常軸索部位の、ERおよびミトコンドリアの分布、さらにMAMsの構造の違いは、有髄軸索のAGJの役割を理解する上で重要であると考えているため、最終年度に詳細に解析する。またHRP標識抗IP3R1抗体を用いた免疫電子顕微鏡解析よりIP3R1はインタ－ノード部位に集まっていることが分かった。
ミエリンの状態と軸索ERおよびMAMsの分布を詳細に観察するため、効率良くin vitroでミエリン形成する方法、すなわち生後0~1日齢の小脳と胎生13~15日齢の小脳原基を混合培養する方法を確立した。この系を用いてミエリン形成過程の軸索IP3R1の局在変化およびMAMsに存在する分子の局在変化を解析する準備を行っている。また軸索腫脹をin vitroで再現し、腫脹形成を経時的に観察するために、生後0~1日齢の正常マウス小脳と胎生13~15日齢CSTkoマウス小脳原基を培養に用いる準備を行っているが、必要マウス胎仔を得ることが出来ず、やや遅れている。
CST-/-/IP3R1+/-マウスはCST-/-/IP3R1+/+マウスと比較して、プルキンエ細胞軸索腫脹の減少に加えて、神経症状が軽減し体重減少も少なかった。IP3R1の量を制御することが重要であることが分かってきた。過剰なIP3R1が、限局した軸索部位のカルシウム濃度上昇を引き起こし、ミトコンドリアをIP3R1陽性腫脹部位に集積させ、MAMsが増えた可能性が考えられる。CST-/-/IP3R1+/-、CST-/-/IP3R1+/+、及びコントロールマウス小脳のMAMs画分を抽出する方法を調べMAMsの状態を生化学的に解析する準備を行っている。
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| 今後の研究の推進方策 |
1. In vitro小脳プルキンエ細胞髄鞘形成培養を用いた実験. CSTkoマウス胎生13日齢 小脳原基と生後0~1日齢小脳を混合培養することにより、プルキンエ細胞軸索の腫脹を再現する。軸索腫脹が効率よく再現できれば、組織学的解析で得た腫脹変化の知見、すなわちIP3R1の局在変化、MAMs局在分子の集積、およびミトコンドリアの変化を経時的に観察し、腫脹形成機序を理解する。またCSTkoマウス軸索腫脹部カルシウム濃度をカルシウムイメージングにより調べる。
2. 小脳MAMs画分の生化学的解析. MAMsは筋萎縮性側索硬化症（ALS）、パーキンソン病、およびアルツハイマー病など様々な神経変性疾患で異常があることが報告され、ミトコンドリアとER膜の隣接した部位であるMAMsを正常に維持することが重要である。しかしながら、MAMsがどのように維持され、特異的な分子が集まってくるのか、特に軸索内のMAMsの分布とミエリンの関係はほとんど研究されていない。AGJ形成不全を呈するCSTkoマウス小脳プルキンエ細胞軸索の腫脹部分には、MAMsの構造が高頻度に観察され、MAMsに存在する分子も集積する。正常コントロール小脳とCSTkoマウス小脳のMAMs画分を精製し生化学的に解析することにより、AGJがMAMsに及ぼす影響を理解できると考える。
3. Sigma1R欠損マウスの解析. SigmaR1の劣性突然変異はALSの原因の一つであり、Sigma1R欠損マウスではミトコンドリア-ER間が障害されMAMsが形成されない。Sigma1R欠損マウスのAGJの形態変化の有無を調べ、AGJに異常がなければCSTkoマウスと交配し、CST/Sigma1R-doublekoマウスプルキンエ細胞軸索の状態を解析する。この解析よりCSTkoマウス軸索腫脹形成にMAMsが関与しているか明らかになると考える。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
論文投稿後の作業が遅延している。投稿論文印刷代として最終年度に必要であるため、次年度使用額とした。
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