| 研究課題/領域番号 |
16K04429
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| 研究機関 | 福島県立医科大学 |
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研究代表者 |
井口 善生 福島県立医科大学, 医学部, 博士研究員 (20452097)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | ノルアドレナリン投射系 / 細胞種特異的活動操作 / ionotropic receptor / フェニル酢酸 / 青斑核 / 前帯状皮質 / マイクロダイアリシス / 高速液体クロマトグラフィー |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は，青斑核(LC)から前帯状皮質(ACC)へ投射するノルアドレナリンが背側線条体の内側部と外側部の機能的バランスを制御し，報酬に基づく意思決定のモードシフト(目標指向性⇔習慣)を実現する，という仮説を検証することである。
平成28年度の計画は，LCノルアドレナリン作動性ニューロン(LCニューロン)特異的な活動操作の妥当性・信頼性を確かめることであった。その方法として，マウスのACCに微小透析プローブを挿入し軸索終末から放出されたノルアドレナリンを捕捉，高速液体クロマトグラフィー用いて定量することとした。
LCニューロンの活動促進の系では，TH-IRトランスジェニックマウスを用いた。このマウスは，チロシン水酸化酵素遺伝子プロモータの下流に，ショウジョウバエより単離された2つのionotropic receptor，IR8aとIR84aの遺伝子をもつ。そのため，TH陽性であるLCニューロンに先天的にIR8a/84a複合体が発現し，フェニル酢酸やフェニルアセトアルデヒドといった果実由来のリガンドに対し興奮性応答することが期待された。
組織学的な解析により，IRが青斑核に強く発現していることが確認された。青斑核近傍にフェニル酢酸を微小注入(0.25 uL)したところ，リガンドが低濃度(0.4% w/v)の条件では，ACCにおける細胞外ノルアドレナリン濃度の一過的な上昇が確認された。一方高濃度リガンド(0.6%)の条件では，数時間にわたる持続的なノルアドレナリン放出量の上昇がみとめられた。したがって，トランスジェニックマウスと外在性リガンドの微小注入を組み合わせることでLCニューロンの活動促進操作が実現可能であり，さらに，注入するリガンドの濃度を変化させることで活動促進の期間も操作可能であることが明らかになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究実績の項に示したように，IR8a/84a複合体とそのリガンドであるフェニル酢酸を用いたLCニューロンの活動促進の系はほぼ完成した。
活動抑制については，当初計画ではイムノトキシン細胞標的法と高頻度逆行性ウィルスベクタ(NeuRet)を併用し，ACCに投射するLCニューロンを選択的に除去することで実現することを目標としていた。イムノトキシンは，ヒトインターロイキン-2受容体αサブユニット(hIL-2Rα)の抗体と緑膿菌の融合タンパクであり，hIL-2Rαを発現するニューロン特異的に細胞死を誘導する。一方，NeuRetは注入部位に投射する軸索終末よりニューロン内部に侵入し，軸索内を逆行性に輸送されて細胞体に到達した後，導入遺伝子を高頻度発現させる。そこでhIL-2Rαを導入遺伝子としてもつNeuRetを野生型マウスの前帯状皮質に微小注入し，LCニューロンの細胞体にhIL-2Rαを発現させた。
平成28年度の研究ではここまでは実施したが，次年度以降に残された検討課題として，①同マウスの青斑核にイムノトキシンを注入し，LCニューロンの選択的な除去がおきることを組織学的に検討すること，②同マウスの前帯状皮質における細胞外ノルアドレナリン濃度の低下が起きるか検討すること，の2点が残された。
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| 今後の研究の推進方策 |
申請段階では，活動抑制のために使うことができるツールとして，イムノトキシン細胞標的法とNeuRetを組み合わせたアプローチが有効だと思われた。しかしその後，IRと同様の外在性イオンチャネル共役型受容体で，陰イオンを細胞内に透過させることにより過分極を誘導するシステム(センチュウ由来で，イベルメクチンをリガンドとするGluCL受容体)が利用できる見込みが立った。これは細胞死を誘導する前者の方法とは異なり操作がrevesibleであることから，より生理的な条件に近い条件における検討を可能にし，また，IRシステムの効果との比較も容易になる。今後の技術開発の進展によっては，こちらのシステムの導入を前向きに検討する。
平成29年度以降は，LCニューロンの活動促進・抑制により，その下流に位置すると予想される背側線条体の神経活動が影響を受けるのかどうか，神経細胞の非直接的な活動性マーカーであるc-Fosの発現を指標として検討する。同時に，LCニューロンの投射先である前頭前皮質・海馬・扁桃体など，全脳にわたる解析をおこなう。これが確認された段階で，LCニューロンの活動操作と意思決定の関係を検討するために，マウスやラットに道具的学習を施し，LCニューロンの活動操作をおこなった上で，道具的行動の報酬価値に対する感受性が変化するかどうかを検討する予定である(平成29年秋以降)。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成28年度に，ACCに投射するLCニューロンの活動抑制の系を作出するために，イムノトキシン細胞標的法と高頻度逆行性ベクタを組み合わせて同ニューロンを選択的に除去し，ACCにおける細胞外ノルアドレナリン濃度をマイクロダイアリシス法を用いて定量する計画を立てていた。
しかしこの方法は，細胞死を誘導するため生理的条件からの逸脱が相対的に激しいこと，開発がほぼ完成をみた活動促進技術であるIRシステムとの対照が難しいこと，コンディショナルな活動操作が不可能で，ダイアリシス法ではベースラインの変化だけしか検討できないこと，などの難点を抱えていた。
その後，センチュウ由来のGluCL受容体と外在性リガンド・イベルメクチンを用いたreversibleな活動抑制系が使用可能な見込みが立った。そのため，前者の方法も進めつつ，後者の技術開発にあたった。前者のダイアリシス実験を延期することになったため，未使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
このため，GluCLシステムを用いた活動抑制技術の妥当性検討と，国内学会におけるその成果発表を次年度におこなうこととし，未使用額はその経費に充てることとしたい。
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