多種類の生体分子を順序つけて2次元膜上に整列提示するナノブロックの開発

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 16K04888
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 飯嶋 益巳 大阪大学, 産業科学研究所, 特任准教授 (40390728)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: ナノバイオ / ナノ材料 / バイオテクノロジー / 生体分子 / 酵素反応

研究実績の概要

研究代表者は、IgG-Fc結合ZZタグを整列提示するバイオナノ粒子（ZZタグ提示型バイオナノカプセル：ZZ-BNC）が、バイオセンシング表面においてIgG及びFc融合受容体の配向性を精密に制御し「クラスター化と整列提示化」を同時に達成できる耐久性の高い足場分子であることを見出し、各種バイオセンシングの高感度化を示してきた。そこで本研究は、ZZ-BNC足場技術を「酵素」の整列提示化に発展させ、インビトロでの生産が困難なフラボノイド生合成経路を例に用いて、フラボノイド合成酵素群を整列提示できる改変型ZZ-BNCを作製し、さらに、同一固相上（2次元膜上）で生合成経路の順番に酵素を整列提示できるユニークな「ナノブロック型足場技術」の開発を目指している。平成28年度は、各種アミノ酸Tagに対するAffibodyを全自動1細胞単離解析装置を用いてスクリーニングし、Affibody提示BNCの作製法を検討した。また、フラボノイド合成酵素群の各酵素と、各アミノ酸Tagを融合したAffibody-酵素-アミノ酸Tag提示BNCの作製法を検討した。両作製法は本研究課題の基盤技術となることから、その検討意義、重要性は高いと考える。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

H28年度は、各種アミノ酸Tagに対するAffibodyライブラリーの作製方法及び全自動1細胞単離解析装置を用いてAffibodyをスクリーニングする方法を検討し、Affibody提示BNCの作製を進めている。さらに、フラボノイド合成酵素群の各酵素と、各アミノ酸Tagを融合したAffibody-酵素-アミノ酸Tag提示BNCの作製を進めていることから、当初の計画通り、おおむね順調に進展していると考える。

今後の研究の推進方策

H28年度に引き続き、Affibody提示BNCの作製法およびAffibody-酵素-アミノ酸Tag提示BNCの作製法を検討する。さらに、BNCとリポソームの融合法を用いて2次元膜上で各酵素が生合成経路の順番に整列提示するナノブロックの構築を検討するのと同時に、各酵素の整列提示化の形状をHS-AFMを用いて観察する方法を検討する。なお、これらの研究により得られた成果は、原著論文、学会、ホームページ等で幅広く発表する。

次年度使用額が生じた理由

平成28年度に実施した研究において、全自動1細胞単離解析装置の高感度化が可能になったことで、当初の使用計画で計上した物品費（消耗品費）の、特に蛍光試薬類の過剰な使用を削減できた。そこで本研究費は、次年度の研究計画に必要な物品費、特に使用頻度が増えることが予想されるAFM観察関連の消耗品費に使用することとしたため、次年度使用額が生じた。

次年度使用額の使用計画

平成28年度と同様に、主に物品費（消耗品費）、旅費（学会発表や研究セミナー参加等）、その他（論文投稿費、印刷費）、について使用する。なお、物品費（消耗品費）は、一般試薬、ガラス及び使い捨て器具、タンパク質試薬類などを主として使用する。

研究成果

• [雑誌論文] Scaffolds for oriented and close-packed immobilization of immunoglobulins (2017)
  • 著者名/発表者名: Iijima Masumi、Kuroda Shun’ichi
  • 雑誌名: Biosensors and Bioelectronics 巻: 89 ページ: 810～821
  • DOI: 10.1016/j.bios.2016.10.009
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cytokine-dependent activation of the JAK-STAT pathway in Saccharomyces cerevisiae (2016)
  • 著者名/発表者名: Yoshimoto, N., Ikeda, Y., Tatematsu, K., Iijima, M., Nakai, T., Okajima, T., Tanizawa, K., Kuroda, S.
  • 雑誌名: Biotechnology and Bioengineering 巻: 113 ページ: 1796-1804
  • DOI: 10.1002/bit.25948
  • 査読あり
• [雑誌論文] Bio-nanocapsules displaying various immunoglobulins as an active targeting-based drug delivery system (2016)
  • 著者名/発表者名: Tatematsu, K., Iijima, M., Yoshimoto, N., Nakai, T., Okajima, T., Kuroda, S.
  • 雑誌名: Acta Biomaterialia 巻: 35 ページ: 238-247
  • DOI: 10.1016/j.actbio.2016.02.010
  • 査読あり
• [雑誌論文] Bio-nanocapsule-based scaffold improves the sensitivity and ligand-binding capacity of mammalian receptors on the sensor chip (2016)
  • 著者名/発表者名: Iijima M, Yoshimoto N, Niimi T, Maturana AD, Kuroda S.
  • 雑誌名: Biotechnology journal 巻: 6 ページ: 805-813
  • DOI: 10.1002/biot.201500443
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] 生体分子の整列固定化法 (2016)
  • 著者名/発表者名: 飯嶋益巳、黒田俊一
  • 雑誌名: 生物工学会誌 巻: 94 ページ: 497
  • 査読あり
• [雑誌論文] Scaffold protein enigma homolog 1 overcomes the repression of myogenesis activation by inhibitor of DNA binding 2 (2016)
  • 著者名/発表者名: Nakatani, M., Ito, J., Koyama, R., Iijima, M., Yoshimoto, N., Niimi, T., Kuroda, S., Maturana, A.D.
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 巻: 474 ページ: 413-420
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2016.04.119
  • 査読あり
• [雑誌論文] Mutational analysis of hepatitis B virus pre-S1 (9-24) fusogenic peptide (2016)
  • 著者名/発表者名: Liu, Q., Somiya, M., Shimada, N., Sakamoto, W, Yoshimoto, N., Iijima, M., Tatematsu, K., Nakai, T., Okajima, T., Maruyama, A., Kuroda, S.
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 巻: 474 ページ: 406-412
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2016.04.125
  • 査読あり
• [雑誌論文] RBM20 and RBM24 cooperatively promote the expression of short enh splice variants (2016)
  • 著者名/発表者名: Ito, J., Koyama, R., Iijima, M., Yoshimoto, N., Niimi, T., Kuroda, S., Maturana, A.D.
  • 雑誌名: FEBS Letters 巻: 590 ページ: 2262-2274
  • DOI: 10.1002/1873-3468.12251
  • 査読あり
• [雑誌論文] Core-fucosylation plays a pivotal role in hepatitis B pseudo virus infection: a possible implication for HBV glycotherapy (2016)
  • 著者名/発表者名: Takamatsu S, Shimomura M, Kamada Y, Maeda H, Sobajima T, Hikita H, Iijima M, Okamoto Y, Misaki R, Fujiyama K, Nagamori S, Kanai Y, Takehara T, Ueda K, Kuroda S, Miyoshi E.
  • 雑誌名: Glycobiology 巻: 11 ページ: 1180-1189
  • DOI: 10.1093/glycob/cww067
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cellular uptake of hepatitis B virus envelope L particles is independent of sodium taurocholate cotransporting polypeptide, but dependent on heparan sulfate proteoglycan (2016)
  • 著者名/発表者名: Somiya M, Liu Q, Yoshimoto N, Iijima M, Tatematsu K, Nakai T, Okajima T, Kuroki K, Ueda K, Kuroda S.
  • 雑誌名: Virology 巻: 497 ページ: 23-32
  • DOI: 10.1016/j.virol.2016.06.024
  • 査読あり
• [雑誌論文] High efficiency penetration of antibody-immobilized nanoneedle thorough plasma membrane for in situ detection of cytoskeletal proteins in living cells (2016)
  • 著者名/発表者名: Kawamura, R., Shimizu, K., Matsumoto, Y., Yamagishi, A., Silberberg, Y.R., Iijima, M., Kuroda, S., Fukazawa, K., Ishihara, K., Nakamura, C.
  • 雑誌名: Journal of Nanobiotechnology 巻: 14 ページ: 74-82
  • DOI: 10.1186/s12951-016-0226-5
  • 査読あり
• [学会発表] 抗体を整列固定化する平面膜の開発 (2017)
  • 著者名/発表者名: 飯嶋益巳、黒田俊一
  • 学会等名: 日本農芸化学会2017年度大会
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 2017-03-17 – 2017-03-20
• [学会発表] バイオセンサー表層におけるセンシング分子のナノレベル精密整列化に関する研究 (2017)
  • 著者名/発表者名: 飯嶋益巳
  • 学会等名: 日本農芸化学会2017年度大会
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 2017-03-17 – 2017-03-20
  • 招待講演
• [学会発表] ナノニードルアレイを用いた機械的細胞分離技術の開発 (2017)
  • 著者名/発表者名: 松本雄太、飯嶋益巳、黒田俊一、山岸彩奈、中村 史
  • 学会等名: 日本化学会第97春季年会（2017）
  • 発表場所: 神奈川
  • 年月日: 2017-03-16 – 2017-03-19
• [学会発表] 細胞骨格の機械的特性の解析に向けた中間径フィラメントの引張試験 (2017)
  • 著者名/発表者名: 須崎 萌、竹田 至、山岸 彩奈、飯嶋 益巳、黒田 俊一、岡田 知子、金 賢徹、中村 史
  • 学会等名: 第64回応用物理学会春季学術講演会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2017-03-14 – 2017-03-17
• [学会発表] Reconstituted planar ZZ-L membrane for the oriented immobilization of immunoglobulin G on biosensors (2016)
  • 著者名/発表者名: Iijima, M., Kuroda S.
  • 学会等名: The 20th SANKEN International The 15th SANKEN Nanotechnology Symposium, The Institute of Scientific and Industrial Research (ISIR)
  • 発表場所: Osaka, Japan
  • 年月日: 2016-12-12 – 2016-12-13
  • 国際学会
• [学会発表] Synthesis and assembly of hepatitis B virus envelope protein-derived particles in Escherichia coli (2016)
  • 著者名/発表者名: Li, H., Onbe, K., Liu, Q., Iijima, M., Yoshimoto, N., Nakai, T., Tatematsu, K., Okajima, T., Seno, M., H, Tada., Kuroda, S.
  • 学会等名: The 20th SANKEN International The 15th SANKEN Nanotechnology Symposium, The Institute of Scientific and Industrial Research (ISIR)
  • 発表場所: Osaka, Japan
  • 年月日: 2016-12-12 – 2016-12-13
  • 国際学会
• [学会発表] High efficiency insertion of antibody-immobilized nanoneedle into living cells for in situ detection of cytoskeletal proteins (2016)
  • 著者名/発表者名: Nakamura, C., Shimizu, K., Kawamura, R., Iijima, M., Kuroda, S., Fukazawa, K., Ishihara, K.
  • 学会等名: PRiME2016
  • 発表場所: Honolulu, Hawaii
  • 年月日: 2016-10-02 – 2016-10-07
  • 国際学会
• [学会発表] センシング分子を最密充填状態で精密に整列固定化する二次元膜の開発 (2016)
  • 著者名/発表者名: 飯嶋益巳、黒田俊一
  • 学会等名: 第68回日本生物工学会大会
  • 発表場所: 富山
  • 年月日: 2016-09-28 – 2016-09-30
• [学会発表] ナノニードルアレイを用いたビメンチン陽性癌細胞分離技術の開発 (2016)
  • 著者名/発表者名: 松本雄太、川村隆三、飯嶋益巳、黒田俊一、中村 史
  • 学会等名: 第68回日本生物工学会大会
  • 発表場所: 富山
  • 年月日: 2016-09-28 – 2016-09-30
• [学会発表] 様々な抗体を提示可能なバイオナノカプセルによる能動的標的化DDSナノキャリアの開発 (2016)
  • 著者名/発表者名: 立松健司、李昊、飯嶋益巳、黒田俊一
  • 学会等名: 第68回日本生物工学会大会
  • 発表場所: 富山
  • 年月日: 2016-09-28 – 2016-09-30
• [学会発表] Reconstituted ZZ-L particles and planar ZZ-L membrane for the oriented immobilization of Fc-fused molecules on various types of biosensors. (2016)
  • 著者名/発表者名: Iijima, M., Kuroda S.
  • 学会等名: Biosensors2016
  • 発表場所: Gothenburg, Sweden
  • 年月日: 2016-05-25 – 2016-05-27
  • 国際学会
• [学会発表] High efficiency penetration of antibody-immobilized nanoneedle thorough plasma membrane for in situ detection of cytoskeletal proteins in living cells (2016)
  • 著者名/発表者名: Shimizu, K., Kawamura, R., Iijima, M., Kuroda, S., Fukazawa, K., Ishihara, K., Nakamura, C.
  • 学会等名: Biosensors2016
  • 発表場所: Gothenburg, Sweden
  • 年月日: 2016-05-25 – 2016-05-27
  • 国際学会
• [備考] ZZ-BNCを用いた生体分子のナノレベル整列固定化技術
  • URL: http://www.sanken.osaka-u.ac.jp/labs/smb/index.html
• [産業財産権] 医薬 (2017)
  • 発明者名: 黒田俊一、飯嶋益巳、立松健司
  • 権利者名: 黒田俊一、飯嶋益巳、立松健司
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 2017-054937
  • 出願年月日: 2017-03-21