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2016 年度 実施状況報告書

深部超解像観察に向けた多光子過程を制御した蛍光顕微鏡の開発

研究課題

研究課題/領域番号 16K04983
研究機関東京理科大学

研究代表者

須田 亮  東京理科大学, 理工学部物理学科, 教授 (80250108)

研究期間 (年度) 2016-04-01 – 2019-03-31
キーワード深部観察 / 多光子過程 / 蛍光顕微鏡 / 超解像イメージング
研究実績の概要

本研究課題では、細胞や生体組織の深部で高い分解能の蛍光観察を実現するため、二光子励起顕微鏡において蛍光標識となる蛍光タンパク質の発光波長を切り換え、さらに意図的に褪色させる光励起法を確立し、これをもとに時空間集光法による広視野二光子顕微鏡を用いて、超解像二光子蛍光イメージング技術を開発することを目的とする。
平成28年度は、これまでに取得した分光データをもとに、蛍光タンパク質の光褪色の速度を観測した。CWレーザーを用いた一光子励起による蛍光発光を観察しながら、励起状態吸収(ESA)に同調した別のCWレーザーを用いて褪色させて、蛍光強度の減衰速度を観測したところ、二つのレーザー光(eGFPの場合、波長473 nmの励起光と波長760 nmのESA誘起光)の強度比と褪色速度の関係から分光結果と矛盾しないことが確認された。また、両者の遅延時間を変えることにより励起状態吸収の発端となる準位を探索したところ、一重項励起状態(S1)、三重項励起状態(T1)、その他の暗状態からほぼ同程度に褪色が生じていることが明らかとなった。したがって、ESA誘起光の波長を制御することにより、所要の部位およびタイミングで蛍光分子を褪色させることが可能になると考える。次に、CWレーザーに代えてフェムト秒レーザーを用いた二光子励起においてESA誘起光による褪色の実験を予定していたが、フェムト秒レーザー装置の故障により年度内に実施できなかった。現在、復帰後の調整を終え、実験に着手できる状況にある。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

予定していた二光子励起の実験は、フェムト秒レーザー装置の故障とその修理に予想外の日数を要したことから年度内に実施できなかった。現在、復帰後の調整を終え、実験に着手できる状況にある。

今後の研究の推進方策

平成29年度は、まず前年度に実施できなかったフェムト秒レーザーを用いた二光子励起の実験を行う。ここでは、二光子励起による蛍光分子の発光を観察しながら、ESA誘起光を用いて褪色させて蛍光強度の減衰を観測する。次に、顕微鏡を全反射照明型の構成に代えて1分子レベルでの光変換および光褪色を試みる。また、全反射照明に二光子励起を適用し、超解像観察の模擬実験を行う。
平成30年度は、時空間集光法を用いた二光子励起により試料の深部を面状に励起するとともに、顕微鏡下でESA誘起光を照射し、所要の部位の蛍光分子を光褪色させる。これにより、新たなスライスの蛍光画像を取得し、深部に向かって蛍光観察と光褪色を繰り返すことを試みる。以上の結果を今後の開発の指針としてまとめる。

  • 研究成果

    (8件)

すべて 2017 2016

すべて 学会発表 (8件) (うち国際学会 2件)

  • [学会発表] Adaptive control for two-photon excited fluorescence and photobleaching with a two-dimensional SLM2017

    • 著者名/発表者名
      S. Honda, S. Maesako, N. Kamiyama, K. Toda, and A. Suda
    • 学会等名
      CLEO-Pacific Rim 2017
    • 発表場所
      Marina Bay Sands Expo and Convention Center, Singapore
    • 年月日
      2017-07-31 – 2017-08-04
  • [学会発表] Analysis of triplet/dark state dynamics of fluorescent molecules in the photobleaching process2017

    • 著者名/発表者名
      N. Sakata, S. Maesako, N. Kamiyama, N. Iwata, K. Toda, and A. Suda
    • 学会等名
      CLEO-Pacific Rim 2017
    • 発表場所
      Marina Bay Sands Expo and Convention Center, Singapore
    • 年月日
      2017-07-31 – 2017-08-04
  • [学会発表] 2次元SLMを用いた2光子励起蛍光および光褪色の適応制御2017

    • 著者名/発表者名
      本田成、前迫啓志、神山直人、戸田圭亮、須田亮
    • 学会等名
      第64回応用物理学会春季学術講演会
    • 発表場所
      パシフィコ横浜(神奈川県横浜市)
    • 年月日
      2017-03-15 – 2017-03-17
  • [学会発表] 蛍光分子の光褪色過程における三重項/暗状態の過渡応答解析2017

    • 著者名/発表者名
      坂田のどか、前迫啓志、神山直人、岩田興典、須田亮
    • 学会等名
      第64回応用物理学会春季学術講演会
    • 発表場所
      パシフィコ横浜(神奈川県横浜市)
    • 年月日
      2017-03-15 – 2017-03-17
  • [学会発表] Dynamics of Triplet/Dark States of Fluorescent Molecules in the Photobleaching Process2017

    • 著者名/発表者名
      N. Sakata, S. Maesako, N. Kamiyama, K. Iwata, K. Toda, and A. Suda
    • 学会等名
      ALPS 2017
    • 国際学会
  • [学会発表] Adaptive Control for Reducing Photobleaching in Two-photon Excited Fluorescence2017

    • 著者名/発表者名
      S. Honda, S. Maesako, N. Kamiyama, K. Toda, and A. Suda
    • 学会等名
      ALPS 2017
    • 国際学会
  • [学会発表] EGFPの光褪色過程における三重項/暗状態の過渡応答解析2016

    • 著者名/発表者名
      坂田のどか、前迫啓志、神山直人、岩田興典、須田亮
    • 学会等名
      第2回イメージングフロンティアセンターシンポジウム
    • 発表場所
      東京理科大学 野田キャンパス(千葉県野田市)
    • 年月日
      2016-12-10
  • [学会発表] 二次元空間変調器を用いた二光子励起蛍光及び光褪色の適応制御2016

    • 著者名/発表者名
      本田成、前迫啓志、神山直人、戸田圭亮、須田亮
    • 学会等名
      第2回イメージングフロンティアセンターシンポジウム
    • 発表場所
      東京理科大学 野田キャンパス(千葉県野田市)
    • 年月日
      2016-12-10

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公開日: 2018-01-16  

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