|
本研究課題では細胞や生体組織の深部で高い分解能の蛍光観察を実現するため、二光子励起蛍光顕微鏡において蛍光標識となる蛍光タンパク質の発光波長を切り替え、さらに意図的に褪色させる光励起法を確立し、これをもとに時空間集光法による広視野二光子顕微鏡を用いて、超解像二光子蛍光イメージング技術を開発することを目指した。
まず、蛍光タンパク質eGFPの光褪色速度を測定した。CWレーザーを用いた一光子励起による蛍光発光を観察しながら、励起状態吸収（ESA）に同調した別のCWレーザーを用いて褪色させて蛍光強度の減衰速度を測定したところ、二つのレーザー光（励起光：473 nm、ESA誘起光：750 nm）の強度比と褪色速度の関係から分光結果と矛盾しないことが確かめられた。次に、フェムト秒レーザーを用いた二光子励起により蛍光分子の発光を観察しながら、ESA誘起光により褪色させて蛍光強度の減衰を観測したところ、CWレーザーを用いた一光子励起の実験と同様の結果が得られた。しかし、ESA誘起光の有無による変化量が小さく、超解像観察に必要な程度まで意図的に光褪色を制御することは困難であった。
この原因を明らかにするため、１分子レベルで光褪色を観察することが可能な全反射照明型顕微鏡を構築し、これを用いて従来の蛍光タンパク質溶液を試料とした蛍光褪色の様子と比較した。その結果、ESAに続く電荷移動が暗状態への遷移を促し、可逆的な光明滅を引き起こしていること、不可逆的な光褪色はそれに連動して生じる副次的な現象であることが示唆された。このようなことからESA誘起光で褪色させる方法は今後の進展に委ねることとし、新たに光活性型蛍光タンパク質を二光子励起により活性化する手法を提案し、その基礎データの取得を行った。
|
